本文關(guān)鍵詞： miR-22-3p Sp1 肝癌 增殖 遷移 侵襲　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的:肝細胞癌(下文中簡稱肝癌或HCC)是全世界最常見且惡性程度比較高的腫瘤之一,其發(fā)病率在惡性腫瘤中排在第五位,其死亡率位排第三位。肝癌的綜合治療手段有手術(shù)切除、肝動脈化療栓塞術(shù)、肝移植、射頻消融治療等。手術(shù)治療是肝癌治療的首選方法。肝移植雖然可以獲得較滿意的效果,但是,由于供體肝的缺乏,肝移植術(shù)的開展受到了很大限制。肝動脈化療栓塞術(shù)及射頻消融治療等方法具有相對比較好的療效,然而由于肝癌起病隱匿,所以大部分患者診斷的時候已屬晚期,只有30%~40%的患者可以接受根治性的治療,而對于大部分進展期的肝癌患者不得不接受姑息性的治療。由于各種治療手段的局限性、疾病本身的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、合并基礎(chǔ)肝病的嚴重程度及治療過程中的肝功衰竭等各個方面,仍然限制了各種治療手段療效的提高,與人們的預(yù)期存在較大差異,故迫切需要結(jié)合肝癌的發(fā)病機制研究,進一步研發(fā)新的治療方法,目的為改善肝癌患者的預(yù)后和提高肝癌患者的生存質(zhì)量。Micro RNA(mi RNA),是一組天然的非編碼的小分子RNA,長度約為二十一到二十五個核苷酸,mi RNA可特異性抑制或降解靶m RNA的翻譯從而調(diào)節(jié)靶基因的表達。最近的研究表明,mi RNA在調(diào)節(jié)多種人體內(nèi)發(fā)生的生理或者病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,這些過程包括新陳代謝,細胞分化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。mi RNA在人類腫瘤中可以根據(jù)靶基因的不同而作為調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的致癌基因或抑癌基因。mi RNA-22-3p,前體為pre-mi-22,是在Dicer酶切后形成的產(chǎn)物。到目前為止,有關(guān)mir-22-3p在肝細胞癌中的功能研究及mir-22-3p的靶基因仍未有報導(dǎo)。因此,mir-22-3p在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中的功能作用及其機制值得我們深入去研究。在本研究中,我們擬通過實時定量q RT-PCR檢測mi R-22-3p在肝癌的組織和細胞系中的表達特點;利用化學(xué)合成的方法增強內(nèi)源性mi RNA的功能,通過MTT、細胞周期、細胞遷移和侵襲、裸鼠皮下成瘤等實驗方法來研究mi R-22-3p對于肝癌的增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響;根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果,通過實時定量技術(shù)、蛋白質(zhì)電泳、突光素酶報告實驗確定mi R-22-3p的靶基因。目的為明確mi R-22-3p在肝癌增殖及轉(zhuǎn)移的過程中的功能作用,期望從分子水平探討肝細胞癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移的機理,從而為肝癌的臨床診斷及治療提供分子標記物和目標。方法:1.肝癌中mi R-22-3p的表達特性的鑒定我們用q RT-PCR檢測了20例HCC及其對應(yīng)癌旁組織,以及10例正常肝組織中mi R-22-3p的表達情況。檢測mi R-22-3p在HL-7702、Hep G2、7721、Huh-7、Hep3B這5種細胞株中的表達。2.mi R-22-3p對于肝癌體內(nèi)和體外生物學(xué)特性的影響(1)利用化學(xué)合成的方法,將mimics-mi R-22-3p轉(zhuǎn)染至Hep G2細胞中,然后我們采用MTT細胞增殖實驗、細胞周期實驗、劃痕實驗以及Transwell侵襲實驗檢測mi R-22-3p對于體外肝癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響。(2)利用化學(xué)合成的方法,將antagomirago-mi R-22-3p轉(zhuǎn)染至Hep G2細胞中,將antagomirago-mi R-22-3p轉(zhuǎn)染組細胞注射進裸鼠皮下,然后進一步觀察mi R-22-3p對于Hep G2在裸鼠皮下的成瘤能力的影響。3.mi R-22-3p靶基因的預(yù)測和鑒定(1)應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測軟件micro RNA、Target Scan、Pictar預(yù)測mi R-22-3p調(diào)控的靶基因.(2)利用化學(xué)合成的方法,將mimics-mi R-22-3p及inhibitor-mi R-22-3p轉(zhuǎn)染至Hep G2細胞中,利用Western Blot檢測mimics-mi R-22-3p及inhibitor-mi R-22-3p組及其對應(yīng)NC組細胞中候選靶基因Sp1的表達情況,初步鑒定其是否為mi R-22-3p的靶基因。(3)利用化學(xué)合成方法沉默Sp1(si RNA-Sp1),將si RNA-Sp1轉(zhuǎn)染進Hep G2細胞中,利用熒光定量RT-PCR檢測si RNA-Sp1、si RNA-NC以及NC組的Hep G2細胞中mi R-22-3p的表達情況,以說明Sp1是否影響mi R-22-3p的表達。(4)利用q RT-PCR檢測mi R-22-3p的候選靶基因Sp1在肝癌細胞株Hep G2以及正常肝細胞株HL-7702中的表達情況;利用RNA干擾技術(shù)沉默Sp1(si RNA-Sp1),將si RNA-Sp1轉(zhuǎn)染進Hep G2細胞中,然后采用MTT細胞增殖實驗、劃痕實驗以及Transwell侵襲實驗檢測Sp1對體外Hep G2細胞的增殖、遷移以及侵襲能力的影響。(5)利用雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)來檢測mi R-22-3p與Sp1之間的相互作用來鑒定Sp1是否為mi R-22-3p的靶基因。結(jié)果:1.肝癌中mi R-22-3p的表達特性的鑒定(1)肝癌組織、癌旁組織及正常組織中mi R-22-3p的表達情況我們用q RT-PCR檢測了20例HCC及其對應(yīng)癌旁組織,以及10例正常肝組織中mi R-22-3p的表達情況,結(jié)果顯示:在HCC組織中,mi R-22-3p的表達水平顯著低于其相對應(yīng)的癌旁組織(P0.01)。雖然在癌旁組織中mir-22-3p的表達水平低于在正常肝組織中的表達,但是該差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)q RT-PCR檢測mi R-22-3p在五種細胞系中的表達情況q RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn):以正常細胞系HL-7702為對照,在四種肝癌細胞系中mi R-22-3p的表達均低于在正常細胞系HL-7702中的表達(P0.01),并且在Hep G2肝癌細胞中表達最低。結(jié)果提示:mi R-22-3p在肝癌中的低表達是中的一種很普遍的現(xiàn)象,mi R-22-3p的低表達可能與肝癌的的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。2.mi R-22-3p對于肝癌體內(nèi)和體外生物學(xué)特性的影響a.mi R-22-3p對于肝癌體外生物學(xué)特性的影響(1)將mimics-mi R-22-3p及NC轉(zhuǎn)染到Hep G2細胞中,并通過q RT-PCR檢測其轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示為:轉(zhuǎn)染mimics-mi R-22-3p后,Hep G2細胞中mi R-22-3p的表達水平明顯上調(diào),結(jié)果提示干擾效果顯著(P0.001)。(2)采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染mimics-mi R-22-3p及其NC后的Hep G2細胞,檢測Hep G2細胞的體外增殖能力,然后繪制細胞抑制曲線。結(jié)果顯示mimics-mi R-22-3p組細胞的增殖能力明顯較mimics-NC組受到抑制(P0.05)。結(jié)果提示:過表達mi R-22-3p能抑制肝癌細胞的體外增殖能力。(3)將轉(zhuǎn)染mimics-mi R-22-3p及對應(yīng)NC組細胞進行流式細胞術(shù)檢測肝癌細胞周期。結(jié)果顯示:與NC組及空白對照組相比,mimics-mi R-22-3p組細胞G2期的細胞含量百分比明顯增加(P0.05),說明mi R-22-3p可能使肝癌細胞在G2期受到了阻滯。同時,我們沒有檢測到過表達mi R-22-3p后肝癌細胞的調(diào)亡有明顯改變,因此我們推測mi R-22-3p主耍通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯在G2期,從而抑制細胞的生長。(4)Mimics-mi R-22-3p轉(zhuǎn)染Hep G2細胞后劃痕,在0h和24h拍照,結(jié)果顯示:,mimics-mi R-22-3p轉(zhuǎn)染組細胞的遷移能力(24h劃痕寬度/0h劃痕寬度:mimics-mi R-22-3p組:0.711±0.032,Mimics-NC組:0.327±0.029,空白對照組:0.294±0.041)與mimics-NC組和空白對照組相比有明顯差異(P0.05),過表達mi R-22-3p后Hep G2的細胞遷移能力有明顯的減弱�？梢�,上調(diào)mi R-22-3p后對細胞遷移能力有明顯抑制作用。(5)Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示:Mimics-mi R-22-3p轉(zhuǎn)染組細胞的穿膜細胞數(shù)明顯少于mimics-NC組和空白對照組,Mimics-mi R-22-3p感染Hep G2胞后,Mimics-NC組透膜細胞數(shù)為(129.2±5.5)/視野,空白對照組透膜細胞數(shù)為(119.6±4.4)/視野,Mimics-mi R-22-3p組透膜細胞數(shù)為(69.7±6.7)/視野,Mimics-mi R-22-3p轉(zhuǎn)染組細胞侵襲能力明顯低于imics-NC組和空白對照組細胞(P0.05)。結(jié)果提示:過表達mi R-22-3p可明顯抑制Hep G2細胞體外侵襲能力。b.mi R-22-3p對于肝癌體內(nèi)生物學(xué)特性的影響采用裸鼠皮下成瘤實驗進一步檢測mi R-22-3p對Hep G2細胞在體內(nèi)增殖能力的影響。裸鼠成瘤的統(tǒng)計結(jié)果顯示antagomiragomir-mi R-22-3轉(zhuǎn)染細胞注射組的裸鼠成瘤能力較antagomirago-NC組和空白對照組顯著增高。3.mi R-22-3p靶基因的預(yù)測及鑒定(1)應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測軟件micro RNA、Target Scan、Pictar預(yù)測mi R-22-3p調(diào)控的靶基因。初步候選Bcl2,CCND1,Sp1成為預(yù)測結(jié)果中的靶基因,其中Sp1可能性最大。(2)Western Blot檢測Mimics-mi R-22-3p、Inhibitor-mi R-22-3p及其對應(yīng)NC轉(zhuǎn)染細胞后Bcl2,CCND1,Sp1蛋白的表達。結(jié)果顯示:與Mimics-NC相比,Mimics-mi R-22-3p轉(zhuǎn)染組Hep G2細胞中Sp1蛋白的表達明顯減少(P0.05)。與Inhibitor-NC相比,Inhibitor-mi R-22-3p轉(zhuǎn)染組Hep G2細胞中Sp1蛋白的表達明顯升高(P0.05)。說明了Sp1極有可能是mi R-22-3p的靶基因。(3)已明確mi R-22-3p和Sp1相互之間為逆向作用的關(guān)系后,為了明確是mi R-22-3p作用于Sp1還是Sp1作用于mi R-22-3p,我們把Sp1沉默后用q RT-PCR檢測mi R-22-3p的表達,結(jié)果顯示:mi R-22-3p在si RNA-Sp1組,si RNA-NC組以及空白對照組的細胞之間的表達量沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。說明Sp1并不影響mi R-22-3p的表達。(4)q RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn):Sp1在Hep G2細胞株中的表達水平高于正常細胞株HL-7702(P0.01)。結(jié)果提示:Sp1高表達在肝癌中是一種普遍的現(xiàn)象,Sp1的高表達可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。(5)將si RNA-Sp1及si RNA-Sp1-NC轉(zhuǎn)染到Hep G2細胞中,并通過q RT-PCR檢測si RNA-Sp1、si RNA-NC及空白對照組的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染si RNA-Sp1后Hep G2細胞中Sp1表達水平明顯下調(diào),提示沉默現(xiàn)象明顯(P0.001)。(6)MTT細胞增殖實驗檢測si RNA-Sp1組、si RNA-NC組中Hep G2細胞的在體外增殖能力,然后繪制細胞抑制曲線。si RNA-Sp1組細胞相對于si RNA-NC組中Hep G2細胞的增殖能力明顯受到下調(diào)(P0.05)。結(jié)果提示:抑制Sp1的表達能抑制肝癌細胞的體外增殖能力。(7)si RNA-Sp1轉(zhuǎn)染Hep G2細胞后進行劃痕,在0h和24h時間點拍照,結(jié)果顯示:,si RNA-Sp1組細胞遷移能力(24h劃痕寬度/0h劃痕寬度:si RNA-Sp1組0.688±0.037,si RNA-NC組0.394±0.026,空白對照組0.311±0.032)明顯比si RNA-NC組和空白對照組低(P0.05),沉默Sp1后細胞遷移能力明顯減弱。結(jié)果提示:下調(diào)Sp1后對體外Hep G2細胞的遷移能力有顯著的抑制作用。(8)Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示:si RNA-Sp1轉(zhuǎn)染組細胞的穿膜細胞數(shù)明顯少于si RNA-NC和空白對照組,si RNA-Sp1感染Hep G2胞后,si RNA-NC組透膜細胞數(shù)為(97.2±6.3)/視野,空白對照組透膜細胞數(shù)為(102±4.6)/視野,si RNA-Sp1組透膜細胞數(shù)為(47.2±5.5)/視野,si RNA-Sp1組細胞的侵襲能力顯著低于si RNA-NC組及空白對照組細胞(P0.05)。結(jié)果提示:抑制Sp1的表達能明顯抑制Hep G2細胞的體外侵襲能力。(9)雙螢光素酶系統(tǒng)結(jié)果顯示:3'UTR-NC+mi RNA組和3'UTR+mi RNA相比,有顯著性差異(P0.05),說明mi R-22-3p與靶基因Sp1的3'UTR的結(jié)合,抑制其表達。結(jié)論:1.mi R-22-3p在肝癌細胞中低表達是一種普遍現(xiàn)象,過表達mi R-22-3p可明顯抑制肝癌細胞的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移能力。2.mi R-22-3p可能通過調(diào)節(jié)其靶基因Sp1的表達,從而抑制肝癌細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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