本文關(guān)鍵詞：RASGRF1在結(jié)直腸癌組織中的高表達(dá)及其意義的研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景結(jié)直腸癌是全球第三大惡性腫瘤,在腫瘤死因中排第四位。美國癌癥協(xié)會(American Cancer Society)公布了2014年結(jié)直腸癌相關(guān)數(shù)據(jù),預(yù)測在2014年美國將有136930新發(fā)病例,并估計(jì)50310人將死于該病,是全美第三大腫瘤。由于早期篩查包括大便隱血試驗(yàn)、乙狀結(jié)腸鏡檢查及電子結(jié)腸鏡檢查的普及與治療水平的提高,在發(fā)達(dá)國家結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率已有所下降。而在中國,由于人們生活水平的提高及生活環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)改變及早期篩查意識較差等原因,結(jié)直腸癌發(fā)病率呈上升趨勢,嚴(yán)重地威脅人們的生命健康。據(jù)報(bào)道,20%結(jié)直腸癌在確診時(shí)便為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌,而另外的病例中的50%將在疾病進(jìn)展中出現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤,總生存期約為20個(gè)月。目前研究表明結(jié)直腸癌的形成及進(jìn)展與許多分子及其下游信號通路相關(guān),其中與RAS及RAS信號通路關(guān)系最為密切。通常體內(nèi)RAS蛋白活性受兩類重要的作用相反分子的調(diào)控而處于平衡狀態(tài)：即RASGEFs (Guanine nucleotide exchange factors,鳥嘌呤核苷酸交換因子)和RASGAPs (GTPase activating proteins, GTP酶活化蛋白)。RASGEFs分子可促使非活化狀態(tài)的RAS-GDP轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)的RAS-GTP,開放RAS信號通路,而RASGAPs則可通過增加RAS蛋白內(nèi)源性的GTP酶活性,促進(jìn)活性形式的RAS-GTP水解形成RAS-GDP非活性形式,關(guān)閉RAS信號通路,起著負(fù)性調(diào)控作用。當(dāng)RAS突變后(多見于腫瘤狀態(tài)),RAS蛋白不能與RASGAPs結(jié)合,RASGAPs作用喪失。然而,RASGEFs仍然能發(fā)揮作用,導(dǎo)致RAS蛋白始終以RAS-GTP活化狀態(tài),非正常地持續(xù)活化RAS信號通路,主要為RAS-PI3K-Akt信號通路和RAS-RAF-MEK-ERK信號通路,促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡并最終向惡性型轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。RAS-GEFs超家族成員包括RASGRF1/2, SOS1/2, RASGRP1/2/3/4 (CalDAG-GEFs), C3G, Epac 1/2 (cAMP-GEFs), RalGDS家族成員,RalGPS, PDZ-GEFs, BCAR3,MR-GEF, Smg GDS和磷酯酶Cε等。多個(gè)研究表明RASGEFs可能作為促癌因子在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用,且對于野生型及突變型KRAS基因都有調(diào)控作用。RASGRF1為RASGEFs超家族成員之一,Tarnowski, M.等的研究發(fā)現(xiàn)RASGRF1在橫紋肌肉瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤中表達(dá)升高,下調(diào)RASGRF1可抑制這些腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移。我們的前期研究篩查了結(jié)直腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞中的RASGEFs mRNA表達(dá)譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RASGRF1, SOS1, RASGRP1, RASGRP2四個(gè)分子在結(jié)直腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)明顯增高。同時(shí)我們也已發(fā)現(xiàn)干擾RASGRF1表達(dá)可以減少RAS-GTP形成,即干擾RAS蛋白活化。目前關(guān)于RASGRF1在結(jié)直腸癌組織表達(dá)情況及其臨床意義,及調(diào)節(jié)RASGRF1對結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為影響尚未見報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。目的通過免疫組織化學(xué)二步法檢測結(jié)直腸癌病人癌組織和癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤中RASGRF1的表達(dá),進(jìn)一步分析結(jié)直腸癌組織RASGRF1表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性,探討其在結(jié)直腸癌中的可能作用及臨床意義。通過RNAi技術(shù)下調(diào)KRAS突變型結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的RASGRF1表達(dá)水平,檢測對細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移能力影響,初步探討RASGRF1對結(jié)腸癌細(xì)胞株生物學(xué)行為作用,為結(jié)直腸癌早期診斷、預(yù)后及靶向治療提供新的分子靶標(biāo)。方法1.收集廣東省人民醫(yī)院2008年至2011年間經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)診斷,具有完整病例資料的35例非連續(xù)結(jié)直腸癌組織、35例癌旁正常結(jié)腸組織(距離癌組織大于5cm以外的癌旁組織)、35例結(jié)直腸腺瘤組織石蠟包埋標(biāo)本。標(biāo)本按照標(biāo)準(zhǔn)流程制成厚度約4gm石蠟切片。所有結(jié)直腸癌患者手術(shù)前均未接受過放療、化學(xué)治療及免疫治療、生物治療。結(jié)直腸癌的分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)/國際抗癌聯(lián)盟(UICC)結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)(第七版)。2.用EnVision二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,檢測RASGRF1在結(jié)直腸癌組織、結(jié)腸腺瘤組織、癌旁正常組織石蠟切片中表達(dá)部位及強(qiáng)度。主要步驟如下：切片在65℃烤箱放置3小時(shí),二甲苯、酒精浸泡脫蠟及水化。新鮮配制抗原修復(fù)液Tris-EDTA1500-3000ml,高溫高壓修復(fù)3分鐘。冷水沖淋高壓鍋,以盡快降壓,自然冷卻20分鐘至室溫。雙蒸水泡洗切片。免疫組化油性筆圈化組織,加入3% H2O2 100ul,室溫下避光孵育10分鐘,PBS洗切片。10%羊血清室溫封閉10分鐘,小心甩去封閉液。加入50u1一抗RASGRF1抗體稀釋液,濕盒4℃孵育過夜。次日室溫下復(fù)溫30分鐘。PBS沖洗。滴加50-100u1二抗A液(Envision+/HRP)于組織上,室溫下孵育40分鐘。PBS沖洗。滴加50-100ulDAB工作液,光鏡下控制顯色,蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木素復(fù)染及自來水中返藍(lán)。梯度酒精、二甲苯浸泡脫水。中性樹脂封片膠封片,烤片至干。3.轉(zhuǎn)染KRAS突變型結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116:轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)70%左右。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組及空白對照組。按照每孔200μL Opti-MEM Reduced serum Medium及每孔5μLMAX的量分別取適量,進(jìn)行混合,此為溶液A。按照說明書推薦的最適RASGRF1 siRNA轉(zhuǎn)染濃度計(jì)算出每孔需加入的RASGRF1 siRNA體積。按照每孔200μL Opti-MEM Reduced serum Medium及每孔適宜量RASGRF1 siRNA,進(jìn)行混合,此為溶液B。將溶液A與溶液B進(jìn)行混合,輕輕混勻,在室溫下孵育20分鐘。與此同時(shí),棄去原6孔板中培養(yǎng)基,用無血清培養(yǎng)基輕柔沖洗兩遍后,每孔加入2mLOpti-MEM Reduced serum Medium。 20分鐘后,將混合液均勻分入每孔中,輕輕前后晃動(dòng)6孔板使其混合混勻,將6孔板置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。4.CCK-8檢測細(xì)胞增殖：取生長良好無污染且處于對數(shù)期的細(xì)胞,取適量胰酶消化,制備細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度至104個(gè)每孔,接種至96孔板。培養(yǎng)24小時(shí),按照上述方法轉(zhuǎn)染RASGRF1 siRNA及陰性對照,培養(yǎng)48小時(shí)；每孔加入10μL CCK-8,用酶標(biāo)儀在450nm波長下分別測定加入CCK-8后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的OD值。以時(shí)間為橫軸,增殖率為縱軸繪制生長曲線。5.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：取生長良好無污染且處于對數(shù)期的細(xì)胞,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時(shí)后,將細(xì)胞培養(yǎng)板各組的培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)移到15ml的錐形管中并置于冰上。用2 ml冰PBS溶液輕輕潤洗培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞,去除PBS溶液。加入0.5ml 0.25%不含EDTA胰酶,收集細(xì)胞。將細(xì)胞輕輕重懸于上述的培養(yǎng)基中使得其密度大約為1×106細(xì)胞/ml。將0.5 ml細(xì)胞懸液從細(xì)胞培養(yǎng)板中(5×105個(gè)細(xì)胞)轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管內(nèi)。加入1.25μl Annexin V-FITC,室溫(18-24℃)避光反應(yīng)15分鐘。室溫1000xg離心5分鐘,去除上清。將細(xì)胞用0.5 ml預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸。加入10 μl Propidium Iodide。將樣本放置在冰上避光保存。立即用流式細(xì)胞儀檢測分析。6.取生長良好無污染且處于對數(shù)期的細(xì)胞,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時(shí)后每樣收集1×106細(xì)胞細(xì)胞固定：離心收集細(xì)胞,棄上清,用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩次,加入預(yù)冷70%乙醇,于4℃固定過夜。細(xì)胞染色：離心收集細(xì)胞,以1mL的PBS洗細(xì)胞一次,加入500uLPBS含50ug/mL溴化丙錠(PI), 100ug/mL RNase A,0.2% Triton X-100,4℃避光孵育30分鐘。流式分析：以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測,一般計(jì)數(shù)2-3萬個(gè)細(xì)胞,結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。7.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取生長良好無污染且處于對數(shù)期的細(xì)胞,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時(shí)后,吸除原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,加入滅菌的PBS洗液,輕輕漂洗。加入適量0.25%的胰蛋白酶,收集細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中離心,計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞,用100ul無血清培養(yǎng)基重懸,加入Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板的小室上室,在下室加入600ul完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時(shí)后,取出小室,用棉簽擦去上室的細(xì)胞,4%多聚甲醛固定2Omin, PBS洗滌一次,結(jié)晶紫染色10min, PBS洗滌一次,顯微鏡下觀察細(xì)胞穿過小孔數(shù)目,并拍照統(tǒng)計(jì)。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 13.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對正態(tài)分布的連續(xù)性變量采用(x±s)描述,非正態(tài)分布的連續(xù)性數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)描述。采用多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H檢驗(yàn))比較RASGRF1在結(jié)直腸癌組織切片和結(jié)腸腺瘤、癌旁正常組織切片的表達(dá)情況。RASGRF1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性采用兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U檢驗(yàn))及多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H檢驗(yàn))。采用One-way ANOVA分析分別比較KRAS突變型結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 RASGRF1 siRNA 50nm組、RASGRF1 siRNA 100nm組、RASGRF1 siRNA 200nm組與陰性對照組的RASGRF1 mRNA表達(dá)水平之間的差異；采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析及One-way ANOVA分析分別比較KRAS突變型結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 RASGRF1 siRNA 24小時(shí)組、RASGRF1 siRNA 48小時(shí)組、RASGRF1 siRNA 72小時(shí)組與陰性對照組的細(xì)胞增殖變化的差異,當(dāng)滿足方差齊性時(shí)采用LSD法比較組間差異,當(dāng)不滿足方差齊性時(shí)采用Dunnett T3法比較組間差異：采用Kruslal-Wallis H檢驗(yàn)分析KRAS突變型結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116RASGRF 1 siRNA、陰性對照、HCT116細(xì)胞凋亡變化。應(yīng)用Kruslal-Wallis H檢驗(yàn)分析RASGRF1 siRNA組、陰性對照組、HCT1 16組處于G1期細(xì)胞差異；用One-way ANOVA分析分別比較RASGRF1 siRNA組、陰性對照組、HCT116組處于S期細(xì)胞差異,當(dāng)滿足方差齊性時(shí)采用LSD法比較組間差異,當(dāng)不滿足方差齊性時(shí)采用Dunnett T3法比較組間差異；HCT116 RASGRF1 siRNA、陰性對照、HCT116細(xì)胞組細(xì)胞遷移能力比較用Kruslal-Wallis H檢驗(yàn)。以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.結(jié)腸癌組織、癌旁正常組織及結(jié)腸腺瘤組織中RASGRF1的表達(dá)情況RASGRF1陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為胞漿中出現(xiàn)棕黃色或深棕色顆粒oRASGRF1蛋白在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤組織均表達(dá)于細(xì)胞漿中,未見明顯胞核染色。RASGRF1在結(jié)直腸癌組織、腺瘤組織及癌旁正常組織中表達(dá)有差異(P=0.038),癌組織高于腺瘤及癌旁正常組織,腺瘤組織高于癌旁正常組織。35例結(jié)直腸腺瘤中17例為管狀腺瘤,18例為絨毛管狀腺瘤,17例管狀腺瘤組織切片中,二者在RASGRF1表達(dá)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.171)。2.結(jié)直腸癌組織RASGRF1表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)一步分析結(jié)直腸癌組織RASGRF1表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性顯示,RASGRF1蛋白表達(dá)與性別(P=0.021)、組織分型(P=0.009)、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.019)及TNM分期(P=0.001)相關(guān),女性高于男性；粘液腺癌、印戒細(xì)胞癌高于腺癌；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；TNM�、�、Ⅳ期高于TNMⅠ、Ⅱ期。與年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、分化不相關(guān)(P0.05)3.CCK8法檢測RASGRF1下調(diào)后對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖能力影響轉(zhuǎn)染后48小時(shí),三組增殖率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007),RASGRF1 siRNA組增殖速度慢于HCT116組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)；轉(zhuǎn)染后72小時(shí),三組細(xì)胞增殖有差異(P=0.000),與NC組及HCT116組相比,RASGRF1 siRNA組增殖速度明顯減慢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000及P=0.000);NC組與HCT116組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.333)。4.Annexin V-FITC/PI法檢測下調(diào)RASGRF1后對HCT116細(xì)胞凋亡影響通過流式細(xì)胞儀檢測了RASGRF1 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況,RASGRF1 siRNA組早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞及總凋亡細(xì)胞均多于NC組和HCT116組(P=0.027),下調(diào)RASGRF1可增加細(xì)胞凋亡。5.下調(diào)RASGRF1后對HCT116細(xì)胞周期影響轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,通過流式細(xì)胞儀檢測RASGRF1 siRNA對KRAS突變型結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示：RASGRF1 siRNA組細(xì)胞處于G1多于NC組及HCT116組(P=0.039),表明下調(diào)RASGRF1后HCT116細(xì)胞阻滯于G1期。與NC組及HCT116組相比,RASGRF1 siRNA組處于S期細(xì)胞明顯減少(P=0.000),下調(diào)RASGRF1后細(xì)胞分裂減少。6.下調(diào)RASGRF1后對結(jié)腸癌HCT116遷移能力影響Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)48小時(shí)后RASGRF1 siRNA組穿過小室的細(xì)胞明顯少于NC組及HCT116組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003),NC組與HCT116組間比較無明顯差異,下調(diào)RASGRF1后HCT116遷移能力下降。結(jié)論結(jié)直腸癌組織中RASGRF1表達(dá)水平高于結(jié)腸腺瘤及結(jié)直腸癌旁正常組織,且與結(jié)直腸癌病人性別、組織學(xué)分型、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān),與年齡、腫瘤部位、大小、組織學(xué)分型、分化等未見明顯相關(guān)。下調(diào)KRAS突變型結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的RASGRF1表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞分裂減少及降低細(xì)胞遷移能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

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1 Yi-Fan Duan;Dong-Feng Li;Yan-Hui Liu;Ping Mei;Yu-Xuan Qin;Liang-Fang Li;Qiu-Xiong Lin;Zi-Jun Li;;Decreased expression of DAB2IP in pancreatic cancer with wild-type KRAS[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2013年02期

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本文編號：1372273