本文關(guān)鍵詞：RNA沉默HIF-1α對NB4急性早幼粒細(xì)胞生物學(xué)行為的影響　出處：《浙江大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：研究低氧狀態(tài)HIF-1α基因干擾對NB4急性早幼粒細(xì)胞的增殖、侵潤和分化等生物學(xué)行為影響,探索HIF-1α對急性早幼粒白血病細(xì)胞分化的相關(guān)機(jī)制。方法：設(shè)計及合成HIF-1α特異性siRNA,構(gòu)建HIF-1α siRNA重組慢病毒和陰性對照組慢病毒,通過感染篩選出最佳慢病毒載體。CoCl2模擬缺氧微環(huán)境,檢測不同濃度梯度對NB4細(xì)胞增殖的影響,選擇最利于NB4細(xì)胞生長的CoCl2濃度,作為模擬缺氧微環(huán)境的終濃度。利用最佳慢病毒載體干擾NB4細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá),RT-PCR檢測HIF-1α的mRNA表達(dá)水平和Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白、VEGF蛋白、SDF-1蛋白的干擾效果,用新型四唑單鈉鹽試劑盒(CCK-8)檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞存活率,用Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測HIF-1α干擾下實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞凋亡水平變化,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞CDllb的表達(dá)以分析NB4的成熟分化程度,探索HIF-1α對急性早幼粒白血病細(xì)胞分化的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果：1、模擬缺氧微環(huán)境,CoCl2終濃度在100μmol/L時,細(xì)胞增殖效率、HIF-1αRNA表達(dá)水平顯著性高于常氧條件培養(yǎng)NB4細(xì)胞(P0.05),對NB4細(xì)胞影響作用最強(qiáng)。2、MOI為25、50、75時,GFP表達(dá)率均值為50.6%、75.3%、98.2%,三組MOI存在顯著性差異(P0.01),因此選擇MOI為75是較合理的選擇。3、流式細(xì)胞術(shù)檢測感染細(xì)胞上GFP表達(dá)強(qiáng)度,評估慢病毒干擾細(xì)胞株NB4轉(zhuǎn) 染效率,與陰性慢病毒比較,慢病毒4對于NB4細(xì)胞的熒光感染效率最低(P0.01),慢病毒1、慢病毒2、慢病毒3感染效率很高且彼此間無顯著性差異(P0.05); RT-PCR檢測各組感染細(xì)胞中HIF-1α RNA表達(dá)情況,與陰性對照相比,慢病毒2感染NB4細(xì)胞HIF-1α表達(dá)率最低(P0.01),慢病毒2載體干擾NB4細(xì)胞可作為實(shí)驗(yàn)組。4、與陰性對照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率、HIF-1α mRNA抑制率均下降,有顯著性差異(P0.01)；HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和SDF-1蛋白表達(dá)下降(P0.05)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞分化、遷移有顯著性差異(P0.01)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡和死亡的細(xì)胞數(shù)量增加明顯(P0.01)結(jié)論：通過研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和SDF-1蛋白來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生物活性,對NB4的增殖起重要作用；RNA沉默HIF-1α基因,在缺氧狀態(tài),HIF-1α RNA基因表達(dá)下降,HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和SDF-1蛋白均下調(diào),實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制,細(xì)胞凋亡率大大增加,成熟分化比例顯著增加。同時發(fā)現(xiàn)利用CDllb可作為評估早幼粒白血病細(xì)胞向成熟分化的檢測指標(biāo)。本研究利用基因干擾技術(shù),下調(diào)缺氧誘導(dǎo)信號通路中目的基因和相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá),為治療急性早幼粒白血病拓展一種新的基因靶點(diǎn),從基因和蛋白質(zhì)水平科學(xué)評估APL療效,是對APL治療新方法的積極探索。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7

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本文編號：1372589