本文關(guān)鍵詞：吲哚美辛對(duì)白血病細(xì)胞增殖和細(xì)胞衰老的影響　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:近年來,有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶-2(COX-2)在包括白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達(dá)增強(qiáng),并認(rèn)為其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附等作用相關(guān)。而非甾體類抗炎藥物可以抑制環(huán)加氧酶(cyclooxygenase,COX)的活性,因而可能對(duì)腫瘤產(chǎn)生抑制作用。本研究通過觀察吲哚美辛對(duì)白血病細(xì)胞體外增殖與細(xì)胞衰老的影響,以分析非甾體類抗炎藥物對(duì)白血病是否有輔助治療作用。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù)實(shí)驗(yàn)選用三種常見的白血病細(xì)胞株(U266、K562、U937),將三種細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清(FBS)的IMDM培養(yǎng)基中,置37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。調(diào)整每個(gè)培養(yǎng)基中細(xì)胞濃度為104/ml,以終濃度為30μM的吲哚美辛分別處理三種細(xì)胞作為干預(yù)組,以加入相同體積吲哚美辛的溶劑DMSO作為對(duì)照組。2.細(xì)胞增殖抑制的臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三種細(xì)胞以培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為104/ml接種于24孔培養(yǎng)板中,以終濃度為30μM的吲哚美辛分別處理三種細(xì)胞作為干預(yù)組,以不加藥組作為對(duì)照組,每組設(shè)4個(gè)平行孔。分別培養(yǎng)0、4、7天后收集細(xì)胞,離心并重懸制備成單細(xì)胞懸液,進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,5min內(nèi)用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)算死亡細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)。光鏡下觀察,未染色的為活細(xì)胞,染成淡藍(lán)色的則為死亡細(xì)胞。活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))x100%。3.細(xì)胞周期測(cè)定取各組細(xì)胞以104/ml密度按前述分組培養(yǎng)三種細(xì)胞系。PBS清洗一次,加入70%冰乙醇置于4℃冰箱固定過夜。按照細(xì)胞周期測(cè)定說明書要求標(biāo)記細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞比率的變化。4.細(xì)胞凋亡檢測(cè)依據(jù)上述條件調(diào)整細(xì)胞密度后分組培養(yǎng)。用Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)收集培養(yǎng)4天后的各組細(xì)胞。1000rpm離心5min,用冰PBS洗滌一遍后,再用分析緩沖液清洗一遍,重懸制備成單細(xì)胞懸液。按照試劑盒說明書操作標(biāo)記細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。5.細(xì)胞衰老測(cè)定如上所述分組培養(yǎng)0、4、7天后收集細(xì)胞。用PBS清洗一遍,按照細(xì)胞衰老檢測(cè)試劑盒說明書操作檢測(cè),光鏡下觀察計(jì)數(shù)衰老細(xì)胞數(shù)。衰老細(xì)胞率(%)=衰老細(xì)胞總數(shù)/(衰老細(xì)胞總數(shù)+正常細(xì)胞總數(shù))x100%。6.增殖抑制基因p21、p27m RNA水平變化的RT-PCR檢測(cè)以培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為104/ml,采用上述分組培養(yǎng)細(xì)胞4天后,按High Pure PCR Product Purification試劑盒說明書操作,提取RNA,分光光度計(jì)定量。根據(jù)Ta Ka Ra公司m RNA Selective PCR試劑盒說明書采用一步法RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。各種引物序列用Premier5.0軟件設(shè)計(jì),以GAPDH作為內(nèi)參。結(jié)果:1.吲哚美辛對(duì)三種細(xì)胞系細(xì)胞活率的影響加藥培養(yǎng)0、4、7天后使用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)結(jié)果顯示,U266、U937吲哚美辛干預(yù)組細(xì)胞活率與對(duì)照組相比降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(圖1-1,圖1-3),提示終濃度為30μM的吲哚美辛對(duì)U266、U937細(xì)胞增殖有抑制作用;對(duì)K562的抑制作用與對(duì)照組相比無明顯差異(P0.05)(圖1-2)。2.對(duì)細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比U266、U937的吲哚美辛處理組G2/M期細(xì)胞比例顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(圖1-4,圖1-6),這提示吲哚美辛可影響U266、U937細(xì)胞的周期分布,使U266、U937細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯;K562細(xì)胞的周期分布與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(圖1-5)。3.對(duì)細(xì)胞凋亡的影響檢測(cè)結(jié)果顯示,U266、K562、U937對(duì)照組的凋亡率分別為(0.30±0.18)%、(0.31±0.19)%、(0.20±0.12)%;給予吲哚美辛干預(yù)后,細(xì)胞凋亡率分別升高為(3.10±0.42)%、(1.40±0.21)%、(1.38±0.10)%。與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示吲哚美辛誘導(dǎo)U266、K562、U937細(xì)胞凋亡的發(fā)生(圖1-7)。4.對(duì)細(xì)胞衰老的影響與對(duì)照組相比,吲哚美辛處理組K562、U937細(xì)胞衰老率增高顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(圖1-9,圖1-10),U266細(xì)胞衰老率變化不明顯(P0.05)(圖1-8)。提示吲哚美辛可以誘導(dǎo)K562、U937細(xì)胞衰老。5.對(duì)增殖抑制基因p21和p27 m RNA水平的影響RT-PCR檢測(cè)表明,在加藥培養(yǎng)4天后,三種細(xì)胞株(U266、K562、U937)的p21m RNA水平均有所增高,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(圖1-11)。分組培養(yǎng)4天后與對(duì)照組相比,U266、K562的p27m RNA水平也顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而U937的p27m RNA水平與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)(圖1-12)。結(jié)論:吲哚美辛可以對(duì)白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖產(chǎn)生抑制作用,但其機(jī)制可因白血病細(xì)胞的種類不同而異。除抑制白血病細(xì)胞增殖,增加細(xì)胞凋亡外,吲哚美辛可引起多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞、單核細(xì)胞白血病U937細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯,而對(duì)U937細(xì)胞和慢性髓系白血病細(xì)胞K562可以同時(shí)促進(jìn)其細(xì)胞衰老過程。提示非甾體類抗炎藥物可對(duì)白血病起輔助治療作用,但需根據(jù)白血病的類型適當(dāng)選擇。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1326730