本文關(guān)鍵詞：骨肉瘤干細胞的分選及惡性表型的鑒定　出處：《第三軍醫(yī)大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究背景根據(jù)腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)理論,腫瘤實體由大量的具有異質(zhì)性、異構(gòu)的細胞群構(gòu)成。腫瘤干細胞是頂層次結(jié)構(gòu)的亞群,通過對稱和不對稱的分裂實現(xiàn)腫瘤實體的增加,干細胞能夠自我更新和產(chǎn)生其余的腫瘤細胞。與正常人體干細胞不同的是,腫瘤干細胞的擴散、增殖是失控的。與正常人體干細胞相同的是,它維持基因組的完整性、具有自我更新能力、多向分化潛能。隨著腫瘤干細胞理論的提出,生物醫(yī)學方面的研究人員相繼從白血病、肺癌、腦腫瘤、結(jié)腸腫瘤、肝癌等多個惡性腫瘤中分選出了腫瘤干細胞,并在腫瘤干細胞的生物學性狀描述上做了大量工作。隨著研究的深入,逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞所具有的獨特生物學特性,并發(fā)現(xiàn)其在腫瘤發(fā)生、惡性生長、轉(zhuǎn)移、耐藥等多個方面扮演著重要角色。在骨肉瘤的相關(guān)研究中,國內(nèi)外學者相繼從骨肉瘤MG-63、U2OS細胞株中分選出腫瘤干細胞,并進行了一定程度的生物學研究,發(fā)現(xiàn)了其CSCs在細胞表面標記、生長方式、生物學性能等方面與非CSCs的差異,提示骨肉瘤和其他腫瘤一樣,同樣存在CSCs。然而,作為骨肉瘤家族中惡性程度高(高成瘤、高轉(zhuǎn)移率)的骨肉瘤143-B細胞株,卻未見相關(guān)報道。為了進一步研究骨肉瘤CSCs的生物學性能,我們以骨肉瘤143-B細胞株為研究對象,對其進行CSCs的分選,并觀察其生物學特性。第一部分有限稀釋法分選骨肉瘤143-B干細胞目的:探索骨肉瘤干細胞的分選方法,為進一步研究骨肉瘤的生物學特性打下基礎(chǔ)。方法:購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心的143-B細胞株進行常規(guī)培養(yǎng)、傳代,取生長良好的細胞進行軟瓊脂克隆分選、SP分選、有限稀釋法分選,將分選出的細胞進行擴增、傳代,同樣傳至第二代后提取RNA并進行相對定量PCR比較其干性因子Nanog、OCT4的表達。結(jié)果:軟瓊脂克隆法分選出的細胞在Nanog、OCT4的表達上與親代細胞143-B無顯著差異。有限稀釋法及SP分選法分選出的細胞在Nanog、OCT4的表達上高于親代細胞143-B并差異顯著,而有限稀釋法與SP法分選出的細胞兩者之間無明顯差異。結(jié)論:有限稀釋法可有效分選出腫瘤干細胞,并且在Nanog、OCT4的表達上與SP分選法分選出的腫瘤干細胞無顯著差異。第二部分143-B細胞株干細胞的生物學性能目的:探索骨肉瘤143-B細胞株干細胞的生物學性能,進一步了解骨肉瘤并為治療骨肉瘤、提高骨肉瘤患者的生活質(zhì)量、生存時間提供初步實驗依據(jù)。方法:1、成球試驗收集143-B、143-L(有限稀釋法所得到的骨肉瘤143-B細胞株干細胞)二組細胞,并計數(shù),按照一定濃度接種在無血清軟瓊脂孔板中,觀察細胞球形成。2、蛋白印跡法(Western-Blot)分析收集143-B、143-L、143-SP(SP分選法分選骨肉瘤143-B細胞株所得到的腫瘤干細胞)三組細胞,并裂解三組細胞提取總蛋白,以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定三組細胞的總蛋白濃度,Western-Blot檢測三組細胞中Nanog、OCT4的表達情況并進行比較。3、免疫熒光法檢測細胞干性標志物表達將143-B、143-L細胞以相同濃度接種在爬片上,待細胞生長至鋪滿爬片60%左右面積時,給予4%多聚甲醛固定,進行免疫熒光檢測Nanog、OCT4在143-B、143-L中的表達情況并進行比較。4、細胞多向分化潛能潛能的檢測收集143-B、143-L細胞并計數(shù),以相同濃度接種在12孔孔板中,分別進行成骨誘導分化試驗、成脂、成軟骨誘導分化試驗,觀察兩組細胞在成骨分化、成脂、成軟骨分化的能力并進行比較。5、細胞耐藥能力(順鉑、阿霉素)的檢測收集143-B及143-L細胞,以相同濃度將細胞接種在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi),次日換液后加入含有不同濃度順鉑的培養(yǎng)基,24小時后加入細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)試劑并在酶標儀上測定96孔細胞培養(yǎng)板每孔在450nm處的吸光度(D)值,根據(jù)吸光度(D)值及添加的順鉑濃度繪制耐藥曲線,并在耐藥曲線上標出順鉑對該細胞的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration IC50)。并比較細胞存活數(shù)量,進而比較其對順鉑的耐藥能力。6、動物成瘤試驗比較兩組細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力將體重、周齡無顯著差異的18只裸鼠隨機分為6組,143-B及143-L細胞各按照三個劑量組(1×106、1×105、1×104),每個劑量組皮下注射三只裸鼠,定期測量瘤體生長情況及裸鼠體重變化情況,并將兩組細胞相同劑量進行比較。7、統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行處理,確定試驗所得結(jié)果統(tǒng)計學上有意義。結(jié)果:1、143-L具有較143-B更強的成球能力。結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。2、143-L、143-SP較143-B具有更高的Nanog、OCT4蛋白表達。143-L與143-SP在Nanog、OCT4蛋白表達上兩者之間無顯著差異。免疫熒光檢測Nanog、OCT4表達,143-L較143-B同樣顯著增高。結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。3、在相同的誘導分化條件下,143-L細胞具有較強的向成骨細胞分化的能力,143-B細胞向成骨分化能力較弱;143-L細胞具有較強的向脂肪細胞分化能力,143-B不能向脂肪細胞分化;143-L具有向軟骨細胞分化的能力,143-B細胞在誘導階段即不能形成細胞團塊。4、順鉑對143-B的半數(shù)抑制濃度約為0.83ug/m L,對143-L的半數(shù)抑制濃度約為2.51ug/m L。表明143-L較143-B具有更強的對順鉑耐藥能力。阿霉素對143-B的半數(shù)抑制濃度約為0.11 ug/m L,對143-L的半數(shù)抑制濃度約為0.25ug/m L。表明143-L較143-B具有更強的對順鉑、阿霉素耐藥能力。5、143-L及143-B兩組細胞經(jīng)過接種在裸鼠體內(nèi)5周后,143-L細胞在1×105劑量組、1×106劑量組均成瘤,1×104劑量組未能成瘤;而143-B細胞在1×106劑量組、1×105劑量組、1×104劑量組均未能成瘤。結(jié)論:經(jīng)有限稀釋法分選出的腫瘤干細胞,顯著高表達干性因子Nanog、OCT4,具有較親代細胞更強的自我更新能力,具有多向分化潛能,符合腫瘤干細胞的基本特征。且腫瘤干細胞在對腫瘤化療藥物的耐受性方面,遠遠強于親代細胞。異體成瘤能力上,遠遠強于親代細胞。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R738.1

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