本文關(guān)鍵詞：分子靶向藥物17-AAG和RO3280在急性髓系白血病中的作用及其機(jī)制研究　出處：《蘇州大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： Hsp90 17-AAG AML 凋亡 分子靶向 RO3280 AML PLK1 凋亡 靶向致癌基因

【摘要】：第一部分HSP90選擇性抑制劑17-AAG可誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞的凋亡目的：研究熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑17-AAG對(duì)急性髓系白血病(AML)細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)作用及分子機(jī)制,為后續(xù)的臨床研究提供重要依據(jù)。方法：17-AAG以依次遞增的濃度處理AML細(xì)胞株HL60和NB4 24小時(shí)后,使用CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞活性；采用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞的凋亡；采用PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。利用Western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase-3的表達(dá)和活化狀態(tài)。5μM 17-AAG處理NB4細(xì)胞24小時(shí)后,利用凋亡芯片PAHS-3012檢測(cè)17-AAG處理組與DMSO對(duì)照組的370個(gè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。結(jié)果：17-AAG可濃度依賴性地抑制HL60和NB4細(xì)胞的增殖,細(xì)胞周期試驗(yàn)表明,17-AAG加藥組細(xì)胞被阻滯于G2/M期,且隨著時(shí)間和／濃度的增加,細(xì)胞周期發(fā)生紊亂。Annexin V-FITC/PI流式凋亡結(jié)果表明,隨著藥物處理濃度的增加,細(xì)胞凋亡水平增加,其中NB4細(xì)胞凋亡率：DMSO對(duì)照組6.0％4±0.5％,17-AAG 5μM組36.5%±2.2％,17-AAG 10μM組46.9%±3.2%；HL60細(xì)胞凋亡率：DMSO對(duì)照組2.7%±0.7%,17-AAG 5μM組16.7％±2.6％,17-AAG 10μM組30.8%±1.6%。5μM和101μM處理NB4細(xì)胞24小時(shí)后,c-PARP的表達(dá)量隨著濃度的增加而增加,但未檢測(cè)到c-Caspase-3的表達(dá)。PCR Array結(jié)果表明：17-AAG處理NB4細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,凋亡相關(guān)的370多個(gè)基因中,有56個(gè)基因顯著上調(diào),23個(gè)基因顯著下調(diào)。結(jié)論：17-AAG可抑制急性髓系白血病細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡以及阻滯周期于G2/M期。并且,這些作用是通過多種凋亡相關(guān)基因的改變共同實(shí)現(xiàn)的。第二部分腫瘤蛋白PLK1的新型分子靶向抑制劑：R03280誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究目的：探討Polo樣激酶1(PLK1)抑制劑R03280對(duì)人類急性髓系白血病細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用及分子機(jī)制,為后續(xù)的臨床實(shí)驗(yàn)提供重要依據(jù)。方法：Western Blot法檢測(cè)PLK1在白血病細(xì)胞株、AML病人和正常人骨髓中的蛋白表達(dá),RT-PCR法檢測(cè)PLK1在105例兒童AML病人和30例非白血病病人標(biāo)本中的mRNA表達(dá)。應(yīng)用CCK-8比色法觀察不同濃度RO3280、Rigosertib (ON 01910. Na)以及B12536處理AL細(xì)胞株24小時(shí)的生長(zhǎng)抑制作用,同時(shí)檢測(cè)R03280對(duì)原代細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。50nM、00nM RO3280處理白血病細(xì)胞株24小時(shí)后,采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞的凋亡,碘化丙啶染色后流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期,Hoechst 33342熒光染色法觀察藥物處理前后細(xì)胞核的形態(tài)變化。Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白PARP、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)和活化狀態(tài)。采用SABioscience公司的凋亡芯片PAHS-3012檢測(cè)R03280處理組與DMSO組的370個(gè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化情況,并驗(yàn)證候選基因的蛋白表達(dá)。結(jié)果：Western blot結(jié)果表明：PLK1蛋白在白血病細(xì)胞株中均有較高水平的表達(dá),在兒童AML的骨髓樣本中表達(dá)率達(dá)73.3%(11/15),而正常骨髓標(biāo)本表達(dá)很低甚至不表達(dá)；在mRNA水平上,AML病人的PLK1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(106×Log 2(-ΔCt):82.95 ± 110.28 vs.6.36 ± 6.35;p 0.001)0細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)表明,R03280可劑量依賴性地抑制白血病細(xì)胞株及AML原代細(xì)胞的增殖,其在白血病細(xì)胞株中的IC50值為74 nM到797nM之間,而在AML原代細(xì)胞的IC50值在35.49-110.76 nM之間；三種PLK1抑制劑分別處理白血病細(xì)胞株24小時(shí)后,檢測(cè)各組IC50值為：NB4細(xì)胞R0328013.45 nM, ON 01910. Na 13.02 nM, BI253687.65 nM, K562細(xì)胞：RO3280301 nM, ON 01910. Na 1606 nM, BI2536 448 nM,與另外兩種抑制劑相比R03280在HL60與NB4細(xì)胞中的作用最敏感。Annexin V凋亡流式結(jié)果表明,R03280處理細(xì)胞24小時(shí)后,加藥組細(xì)胞較對(duì)照組凋亡水平明顯增加,提示R03280可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡;細(xì)胞周期結(jié)果表明,R03280可阻滯細(xì)胞在G2/M期,其中有些細(xì)胞隨濃度增加出現(xiàn)周期紊亂現(xiàn)象；Hoechst 33342染色后,可觀察到R03280處理組的異常細(xì)胞核及DNA碎片；以50nM和100nM RO3280處理NB4和HL60細(xì)胞24小時(shí)后,c-PARP、c-Caspase3、 c-Caspase9的表達(dá)量隨著濃度的增加而增加。PCR-Array結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,R03280處理NB4細(xì)胞組有32個(gè)基因明顯上調(diào),16個(gè)基因明顯下調(diào)。其中上調(diào)基因DCC,CDKN1A在蛋白水平也顯著上調(diào),下調(diào)基因BTK和SOCS2在蛋白水平也顯著下調(diào)。結(jié)論：R03280可高效抑制急性白血病細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡和阻滯細(xì)胞在G2/M期,該作用可能通過多個(gè)凋亡相關(guān)基因的改變共同實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.71

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