本文關(guān)鍵詞：血清候選標(biāo)志物SAA1和FCN3的發(fā)現(xiàn)與驗證　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：隨著分子生物學(xué)理論和實驗技術(shù)的迅速發(fā)展,生物標(biāo)志物的研究成為一個非常熱門的研究領(lǐng)域。通過對關(guān)鍵生物大分子的測量和分析,有助于疾病的早期診斷或判斷疾病的分期,為改善疾病的診療及預(yù)后提供新思路。生物標(biāo)志物的研發(fā)包括發(fā)現(xiàn)/鑒定、驗證和臨床多中心確認(rèn)三個步驟。在候選蛋白標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和鑒定階段,組學(xué)技術(shù)是篩選差異表達(dá)基因或蛋白的重要方式,聯(lián)合多組學(xué)技術(shù)同時在基因水平和蛋白水平層面分析和篩選疾病差異表達(dá)因子,是近年來研究的熱點；在血清潛在蛋白標(biāo)志物的驗證階段,需要至少兩種不同的方法重復(fù)驗證且要求驗證結(jié)果表達(dá)趨勢一致。一些傳染病由于疾病的特殊性及條件的限制,使得血清潛在標(biāo)志物的驗證目前難以在細(xì)胞和動物模型中完成,質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)技術(shù)為這一類問題提供解決方案�；贛RM質(zhì)譜檢測方法,無需制備抗體,檢測成本低、通量高,一次可以檢測多個目標(biāo)蛋白,在生物標(biāo)志物的驗證環(huán)節(jié)中顯示了較大的優(yōu)越性,也被認(rèn)為是利用質(zhì)譜技術(shù)驗證標(biāo)志物的金標(biāo)準(zhǔn)。為此,本研究嘗試聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和定量蛋白組學(xué)方法及MRM策略,分別篩選與驗證肝癌和涂陰結(jié)核病血清差異表達(dá)蛋白,并探討血清淀粉樣蛋白A1 (serum amyloid A1, SAA1)和纖維膠凝蛋白3 (ficolin 3, FCN3)分別作為肝癌和涂陰肺結(jié)核的血清候選標(biāo)志物的可能性。第一部分基于多組學(xué)策略發(fā)現(xiàn)肝癌血清潛在標(biāo)志物并驗證SAA1目的：聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和定量蛋白組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞株和肝癌血清的共同差異表達(dá)因子,并分析SAA1作為肝癌血清候選標(biāo)志物的可能性。方法：通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)篩選出肝癌細(xì)胞(Smmc-7721)和正常肝細(xì)胞(HL-7702)的差異表達(dá)基因,然后篩選出同時與肝癌轉(zhuǎn)移和炎癥相關(guān)的差異表達(dá)基因。采用定量蛋白組學(xué)方法篩選10例健康對照者和10例肝癌患者血清的差異表達(dá)蛋白,且篩選出同時與肝癌轉(zhuǎn)移和炎癥相關(guān)的差異表達(dá)蛋白。然后聯(lián)合兩種組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)共同差異表達(dá)因子；RT-PCR驗證差異因子在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的表達(dá)水平；收集107例血清(52例健康對照者血清,55例肝癌患者血清,13例肝癌轉(zhuǎn)移患者血清)進(jìn)行ELISA驗證；構(gòu)建受試者工作特征曲線(ROC),并進(jìn)行分析。結(jié)果：轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)7個基因同時與肝癌轉(zhuǎn)移和炎癥相關(guān)；定量蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)14個蛋白與肝癌轉(zhuǎn)移和炎癥相關(guān)。聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)共同與肝癌轉(zhuǎn)移和炎癥相關(guān)的差異表達(dá)蛋白SAA1。 RT-PCR驗證結(jié)果顯示：肝癌細(xì)胞中SAA1蛋白的mRNA水平是正常肝細(xì)胞的3.14倍(P0.0001)。ELISA驗證結(jié)果顯示肝癌轉(zhuǎn)移組、肝癌非轉(zhuǎn)移組和健康對照組血清中SAA1的含量分別為53.24±22.84μg/mL、34.08±19.89μg/mL和25.23±13.58μg/mL,肝癌轉(zhuǎn)移組血清中SAA1的含量顯著高于非轉(zhuǎn)移組(P0.01),而肝癌組的血清SAA1的含量也顯著高于健康對照組(P0.01)。肝癌轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移之間的ROC曲線下面積0.850(P0.001),鑒別肝癌轉(zhuǎn)移的靈敏度和特異度分別是84.6%和81.0%。肝癌和正常對照之間的ROC曲線下面積0.680(P0.01),鑒別肝癌的靈敏度和特異度分別是63.6%和53.8%。結(jié)論：聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和定量蛋白質(zhì)組學(xué)是一種有效的血清蛋白標(biāo)志物的探索方法；炎癥因子SAA1蛋白可能參與肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,值得進(jìn)一步進(jìn)行臨床多中心驗證。第二部分基于MRM策略驗證涂陰肺結(jié)核血清蛋白標(biāo)志物FCN3目的：基于MRM策略驗證涂陰肺結(jié)核潛在蛋白標(biāo)志物,并分析FCN3作為涂陰肺結(jié)核血清蛋白標(biāo)志物的可能性。方法：采集10例健康對照者血清,10例肺炎患者血清和10例涂陰肺結(jié)核患者血清,嚴(yán)格參照MRM質(zhì)譜檢測的操作流程,優(yōu)化質(zhì)譜檢測條件,同時對酸性糖蛋白2抗體(A1AG2)、凝血因子9(FA9)、玻連蛋白(VTN)、血清淀粉樣蛋白A4 (SAA4)和纖維膠凝蛋白3(FCN3)等5個涂陰肺結(jié)核潛在血清標(biāo)志物進(jìn)行相對定量分析；對與前期血清蛋白組學(xué)篩選結(jié)果一致而且分析結(jié)果較好的蛋白FCN3進(jìn)一步ELISA驗證,對FCN3診斷涂陰肺結(jié)核的ROC曲線進(jìn)行分析。結(jié)果：MRM技術(shù)在血清中檢測到5個肺結(jié)核候選血清標(biāo)志物對應(yīng)的鑒定肽段,分離效果和色譜峰形均滿足分析要求。相對定量結(jié)果顯示5個候選血清蛋白質(zhì)均在各組的涂陰肺結(jié)核組中蛋白水平均顯著低于正常對照(P0.05)。ELISA分析發(fā)現(xiàn)FCN3在涂陰肺結(jié)核、肺炎和健康對照三組血清的濃度分別為1060.71±196.10 ng/m1、1219.63±246.34 ng/ml和1267.24± 260.10 ng/ml,涂陰肺結(jié)核中的表達(dá)水平顯著降低(P=0.001),結(jié)果與MRM驗證結(jié)果一致,ROC曲線分析顯示示曲線下面積和臨界值分別是0.929(P0.001)和1152.03ng/ml,診斷涂陰肺結(jié)核的靈敏度和特異度分別是85.61%和82.52%。結(jié)論：MRM質(zhì)譜檢測技術(shù)通量高,能同時檢測多個目標(biāo)蛋白,在血清標(biāo)志物的驗證中具有潛力。多個驗證結(jié)果均顯示FCN3在涂陰肺結(jié)核血清中表達(dá)降低,FCN3作為涂陰肺結(jié)核候選血清標(biāo)志物有一定的應(yīng)用價值。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7;R521

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