發(fā)布時間：2017-12-22 15:42

  本文關(guān)鍵詞：SENP1對骨髓瘤細胞生物學特性的影響及機制研究　出處：《安徽醫(yī)科大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：多發(fā)性骨髓瘤依然是具有較高死亡率和復發(fā)率的.不可治愈的疾病。進一步從分子和基因水平研究其信號通路和調(diào)控將提供新的治療靶點。SUMO蛋白酶1(SENP1)是一個調(diào)控蛋白SUMO化的重要蛋白酶,該酶影響細胞周期、增殖和分化。但SENP1介導的蛋白去SUMO化與骨髓瘤發(fā)病和治療中的作用并不清楚。目的：(1)對SENP1在多發(fā)性骨髓瘤細胞中的表達水平進行研究(2)檢測SENP1敲除對骨髓瘤細胞凋亡、增殖、細胞周期以及集落形成等細胞功能的影響(3)對SENP1與骨髓瘤中重要異常信號通路相互作用做進一步的機制探討方法：(1)以健康捐獻者骨髓單個核細胞做參照,使用real-time PCR、免疫印跡檢測SENP1在3種骨髓瘤細胞系以及6例骨髓瘤病人CD138+細胞中的水平(2)使用含有shRNA的慢病毒感染骨髓瘤細胞系48h后,使用流式細胞儀以及熒光顯微鏡檢測感染效率,并同時使用QPCR,免疫印跡的方法確認敲除效率(3)以感染對照病毒的骨髓瘤細胞做為參照,使用慢病毒shRNA敲除SENP1后利用CKK8試劑盒檢測不同時間點骨髓瘤細胞系的增殖情況(4)感染慢病毒shRNA 48h后,以感染對照病毒細胞做為參照,流式細胞術(shù)檢測SENP1敲除后骨髓瘤細胞凋亡與細胞周期的變化(4)免疫印跡確認IL-6對SENP1的誘導作用、SENP1與NF-κB通路的相互作用以及SENP1敲除對IL-6激活NF-κB的影響,并使用EMSA進一步探究SENP1敲除對NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的作用。結(jié)果：(1)與健康捐獻者骨髓單個核細胞比較,MM細胞中SENP1在RNA和蛋白水平表達增高,差異具有統(tǒng)計學意義,而IL-6能通過STAT3對SENP1產(chǎn)生誘導作用,且呈時間和濃度依賴性。(2)與感染對照病毒骨髓瘤細胞系比較發(fā)現(xiàn),在感染慢病毒shRNAl 48h時,骨髓瘤細胞系XG-7與RPMI8226中SENP1在RNA分別下降至45±1%與87±0.1%,shRNA2則下降至19%±2%與23±1%,差異具有統(tǒng)計學意義在蛋白水平中,SENP1的表達也受到了明顯的抑制。(3)敲除SENP1后,使用流式細胞術(shù)檢測XG-7、RPMI8226的凋亡變化后發(fā)現(xiàn)shRNA2能夠使凋亡細胞增加了40%左右,差異具有統(tǒng)計學意義。使用CCK8方法檢測SENP1敲除后XG-7、RPM8226的增殖變化后發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細胞系的增殖幾乎被完全抑制。在敲除SENP1后48h使用流式細胞儀檢測細胞周期后發(fā)現(xiàn)XG-7中凋亡明顯增加,而RPMI8226 GO/G1期比例明顯增加。SENP1敲除后使用硼替佐米處理后發(fā)現(xiàn)硼替佐米的殺傷作用被增加。(3)進一步機制探討發(fā)現(xiàn)在這一過程中,STAT3位于SENP1的上游。SENP1的敲除同時還能夠抑制NF-kB通路P65、IKBα的磷酸化,并阻斷了NF-κB通路抑制因子IKB α的降解,與此同時,骨髓瘤細胞中SUMO-2結(jié)合總蛋白的水平明顯升高,可以解釋SENP1的敲除引起的NF-kB的抑制。使用IL-6處理SENP1敲除后的骨髓瘤細胞發(fā)現(xiàn)IL-6引起的P65的磷酸化被抑制,SENP1敲除同時還可以導致NF-kB轉(zhuǎn)錄活性的降低。,使用硼替佐米抑制NF-kB通路后發(fā)現(xiàn)SENP1的表達下降,預示了SENP1與NF-kB的相互作用呈環(huán)狀。結(jié)論：SENP1在骨髓瘤細胞系和原代細胞中高表達,SENP1的敲除不僅促進骨髓瘤細胞系的凋亡,還能抑制增殖并對細胞周期產(chǎn)生影響,而硼替佐米對骨髓瘤細胞系的殺傷作用也得到明顯的增加。SENP1的敲除對骨髓瘤細胞系的殺傷與它抑制了NF-κB通路、并部分阻斷了IL-6的作用有關(guān)。本研究為骨髓瘤的治療提供了一個新的治療靶點,為未來的體內(nèi)實驗及進一步的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.3

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本文編號：1320044