本文關(guān)鍵詞：β-胡蘿卜素協(xié)同五氟尿嘧啶對(duì)食管鱗癌的抗腫瘤作用及機(jī)制研究　出處：《鄭州大學(xué)》2016年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：食管鱗癌是我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)較為常見(jiàn)的惡性腫瘤,其致死率在我國(guó)高居第四位。據(jù)報(bào)道,接受手術(shù)治療的食管鱗癌病人總體五年生存率不足20%。目前,化學(xué)治療已成為腫瘤常規(guī)治療的主要方法之一。但是,長(zhǎng)期使用化療藥物,如五氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU),會(huì)造成腫瘤細(xì)胞的耐藥性,并且正常細(xì)胞及組織也會(huì)受到相當(dāng)程度的損害,腫瘤患者不得不因?yàn)檫@些損害而放棄繼續(xù)化療。因此,如何在保證正常組織減輕或免受化療藥物毒副作用的前提下,提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性,是目前惡性腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床治療的一個(gè)亟需解決的難題。近期大量體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),天然化合物協(xié)同化療藥物使用不僅可以減輕化療藥物對(duì)細(xì)胞的毒副作用,同時(shí)還能提高腫瘤細(xì)胞凋亡率。因此,尋找低毒高效且作用靶點(diǎn)廣泛的抗腫瘤天然化合物已成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。β-胡蘿卜素是一種具有重要生理功能的共軛多烯烴類(lèi)化合物,廣泛存在于綠色植物、水果、蔬菜中。β-胡蘿卜素作為維生素A的前體,在人體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為兩分子維生素A,在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。流行病學(xué)研究證實(shí),經(jīng)常食用富含β-胡蘿卜素的蔬菜及水果能夠有效降低各種癌癥的發(fā)生率。研究表明,β-胡蘿卜素具有抗氧化、清除活性氧自由基等功能,并且其抗腫瘤作用可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)有關(guān)。近期研究表明,β-胡蘿卜素可以通過(guò)多種機(jī)制抑制不同腫瘤細(xì)胞的增殖,包括乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤以及前列腺癌等。然而,目前有關(guān)β-胡蘿卜素對(duì)食管鱗癌作用的研究報(bào)道較少,此外,β-胡蘿卜素能否與5-FU發(fā)揮協(xié)同抗癌作用呢?針對(duì)以上問(wèn)題,本課題探討β-胡蘿卜素單獨(dú)或聯(lián)合5-FU的體內(nèi)外抗食管鱗癌作用及其相關(guān)機(jī)制,為β-胡蘿卜素與5-FU聯(lián)合用藥治療食管鱗癌奠定理論基礎(chǔ)。本課題主要分為兩部分:第一部分:以食管鱗癌TE1、EC1、Eca109及正常食管上皮細(xì)胞Het-1A為研究對(duì)象,篩選β-胡蘿卜素作用于食管鱗癌細(xì)胞的最優(yōu)濃度及時(shí)間,并探討β-胡蘿卜素對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期、遷移的影響及其分子機(jī)制;第二部分:以食管鱗癌Eca109細(xì)胞及其裸鼠體內(nèi)移植瘤為體內(nèi)外研究對(duì)象,探討β-胡蘿卜素與5-FU聯(lián)合的抗腫瘤作用及其相關(guān)機(jī)制研究。方法1.體外檢測(cè)藥物對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期、遷移的影響及其機(jī)制探討CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖,篩選出藥物作用于食管鱗癌細(xì)胞的最佳濃度及時(shí)間。藥物處理后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化,Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化,利用Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小窩蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)在m RNA水平表達(dá),Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞粘附因子E-cadherin、細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1及Cav-1/AKT/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白等的表達(dá)水平變化。2.β-胡蘿卜素聯(lián)合5-FU對(duì)裸鼠體內(nèi)移植瘤的抗腫瘤作用及機(jī)制研究皮下注射Eca109細(xì)胞建立食管鱗癌荷瘤裸鼠模型,待腫瘤體積至100~200mm3,將裸鼠隨機(jī)分為四組,即陰性對(duì)照組、β-胡蘿卜素治療組、5-FU治療組、聯(lián)合治療組,每?jī)商旖o藥一次連續(xù)治療三周,通過(guò)測(cè)量荷瘤鼠體重及腫瘤塊體積變化判斷β-胡蘿卜素聯(lián)合5-FU對(duì)荷瘤鼠的毒副作用以及對(duì)荷瘤鼠的治療效果。TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織中Eca109細(xì)胞的凋亡水平,免疫組化檢測(cè)腫瘤中PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)水平,HE染色檢測(cè)裸鼠心肝脾肺腎等組織病理學(xué)變化。結(jié)果第一部分β-胡蘿卜素對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制初步研究1.β-胡蘿卜素對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期和遷移的影響β-胡蘿卜素能夠有效抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖,且具有時(shí)間及劑量依賴(lài)性。其中,30μMβ-胡蘿卜素作用TE1細(xì)胞48 h后,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到50%以上,50μMβ-胡蘿卜素作用EC1和Eca109細(xì)胞48 h后,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均達(dá)到50%。而β-胡蘿卜素對(duì)正常食管上皮細(xì)胞Het-1A并無(wú)生長(zhǎng)抑制作用。與對(duì)照組相比,β-胡蘿卜素能夠顯著促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞株TE1、EC1和Eca109的凋亡(P0.05),且將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期(P0.05),明顯降低周期蛋白Cyclin D1蛋白的表達(dá)(P0.05),并且能夠降低細(xì)胞的遷移能力(P0.05)。此外,粘附因子E-cadherin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著提高。2.β-胡蘿卜素抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖的機(jī)制探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Cav-1在m RNA水平表達(dá)下調(diào),Western Blot結(jié)果表明,Cav-1/AKT/NF-κB信號(hào)通路中Cav-1、p-AKT(Ser473)、p-NF-κBp65(Ser536)和Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,促凋亡因子Bax、Caspase-3表達(dá)上調(diào)。第二部分β-胡蘿卜素聯(lián)合5-FU對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制初步探討1.β-胡蘿卜素聯(lián)合5-FU對(duì)食管鱗癌Eca109細(xì)胞增殖、凋亡、周期和遷移的影響CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn),30μM 5-FU聯(lián)合30μMβ-胡蘿卜素組合處理細(xì)胞36 h后對(duì)Eca109的協(xié)同抑制率為60%±3.17%,而二者單獨(dú)作用抑制率分別為40%±2.03%、22%±3.01%。β-胡蘿卜素單獨(dú)及聯(lián)合5-FU處理后,Eca109細(xì)胞的G0/G1期的細(xì)胞比例增加明顯增加,S期細(xì)胞比例減少,且差異顯著(P0.05)。同時(shí),細(xì)胞明顯出現(xiàn)凋亡特征:體積皺縮,與周?chē)?xì)胞分離,形態(tài)不規(guī)則或變圓,而藥物聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯高于單獨(dú)用藥組和對(duì)照組。此外,與單獨(dú)作用組相比,藥物聯(lián)合組能夠更有效地降低細(xì)胞遷移能力并提升粘附因子E-caherin的表達(dá)。2.β-胡蘿卜素聯(lián)合5-FU抑制食管鱗癌Eca109細(xì)胞增殖的機(jī)制初步探討Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Cav-1/AKT/NF-κB信號(hào)通路中Cav-1、p-AKT(Ser473)、p-NF-κBp65(Ser536)和Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,促凋亡因子Bax、caspase-3表達(dá)上調(diào),且聯(lián)合處理組效果明顯高于β-胡蘿卜素或5-FU單獨(dú)作用組。3.β-胡蘿卜素聯(lián)合5-FU的體內(nèi)抗腫瘤作用治療三周后,測(cè)量的腫瘤體積大小及重量分別是:對(duì)照組,(1198±156)mm3(0.38±0.08)g;β-胡蘿卜素組,(949±92)mm3,(0.28±0.01)g;5-FU組,(652±88)mm3,(0.20±0.05)g;β-胡蘿卜素聯(lián)合5-FU組,(408±61)mm3,(0.12±0.03)g。與對(duì)照組相比,β-胡蘿卜素組或5-FU組腫瘤體積及重量均明顯減小,β-胡蘿卜素聯(lián)合5-FU組與單獨(dú)處理組相比差異顯著(P0.05)。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,β-胡蘿卜素組或5-FU組中Bax/Bcl-2比率、PCNA及Caspase-3表達(dá)水平較對(duì)照組差異性顯著(P0.01);而β-胡蘿卜素聯(lián)合5-FU組中Bax/Bcl-2比率、PCNA及Caspase-3表達(dá)水平較單獨(dú)處理組具有顯著性差異(P0.01)。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組(5.02±0.81%)相比,β-胡蘿卜素(12.15±1.44%)及5-FU單獨(dú)處理組(23.03±2.67%)中Eca109細(xì)胞凋亡率明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);而聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率(38.61±2.45%)較單獨(dú)處理組明顯升高(P0.01)。HE染色檢測(cè)結(jié)果表明,連續(xù)治療裸鼠三周后,藥物并沒(méi)有引起裸鼠各組織病理學(xué)變化。結(jié)論:1.β-胡蘿卜素能夠抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并將細(xì)胞阻滯在G0/G1期,初步分析其可能通過(guò)調(diào)節(jié)Cav-1/AKT/NF-κB信號(hào)通路的活性發(fā)揮其細(xì)胞增殖的抑制作用。2.體外研究表明,聯(lián)合使用β-胡蘿卜素能夠降低5-FU使用量,二者能夠發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤效應(yīng),且協(xié)同抑制Cav-1/AKT/NF-κB信號(hào)通路的活性。3.體內(nèi)研究表明,β-胡蘿卜素能夠增強(qiáng)5-FU對(duì)食管鱗癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.1

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1 何永紅,王瑞淑,黃承鈺;β-胡蘿卜素與癌癥的研究進(jìn)展[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2000年11期

2 白樸;過(guò)量β-胡蘿卜素可誘發(fā)吸煙者肺癌[J];今日科技;2000年02期

3 忻祥法;β-胡蘿卜素研究動(dòng)態(tài)[J];上海醫(yī)藥;2000年09期

4 常峰;王忠彥;胡承;羅t，

本文編號(hào)：1317771