本文關(guān)鍵詞：GCS通過(guò)影響B(tài)CL-2的表達(dá)介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的多藥耐藥　出處：《鄭州大學(xué)》2016年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景與目的在現(xiàn)階段,化療依然是治療終末期腫瘤的主要手段,而腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的形成是導(dǎo)致化療失敗的直接原因,導(dǎo)致預(yù)后不良。多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細(xì)胞在對(duì)某一種化療藥物產(chǎn)生耐藥后,對(duì)其他化學(xué)作用原理不同、結(jié)構(gòu)各異的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。神經(jīng)酰胺在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡方面起著重要作用,而葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶(GCS)可以催化神經(jīng)酰胺糖基化生成葡萄糖神經(jīng)酰胺(Glc Cer),從而可以逃避神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的腫瘤凋亡。越來(lái)越多的證據(jù)表明,腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的形成與細(xì)胞內(nèi)葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶水平升高有著密切的關(guān)系。細(xì)胞中ERK蛋白的高表達(dá)可以促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)上調(diào),作用于細(xì)胞凋亡的下游共同通路,發(fā)揮抗凋亡作用,Bcl-2的抗凋亡作用已被證實(shí)參與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的形成,有文獻(xiàn)報(bào)道,白血病耐藥細(xì)胞中存在GCS與Bcl-2的共同高表達(dá)[1]。但目前GCS與Bcl-2的關(guān)系及作用機(jī)制在結(jié)直腸癌中報(bào)道甚少。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸癌敏感株細(xì)胞HCT-8、耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR及加入GCS抑制劑PPMP后,各組細(xì)胞中GCS、Bcl-2及ERK的表達(dá)情況,探討其相互關(guān)系及可能的作用機(jī)制。方法1細(xì)胞株的培養(yǎng)1)HCT-8組:結(jié)腸癌敏感細(xì)胞HCT-8在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含青霉素、鏈霉素各100 U/m L)中常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度。至少培養(yǎng)2周后,取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2)HCT-8/VCR組:結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR在含1.0μg/ml VCR的培養(yǎng)基中培養(yǎng),以維持其耐藥性。實(shí)驗(yàn)在脫藥培養(yǎng)2周,取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行。3)HCT-8/VCR+PPMP組:HCT-8/VCR細(xì)胞株脫藥培養(yǎng)后,繼續(xù)在含有20μmol/L PPMP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)收集HCT-8組、HCT-8/VCR組和HCT-8/VCR+PPMP組細(xì)胞,提取總蛋白,Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞GCS、Bcl-2及ERK蛋白的表達(dá)情況。3熒光定量PCR法(RT-q PCR)收集HCT-8組、HCT-8/VCR組和HCT-8/VCR+PPMP組的細(xì)胞,提取RNA,RT-q PCR檢測(cè)各組細(xì)胞GCS、Bcl-2及ERK基因的表達(dá)情況。結(jié)果1.結(jié)腸癌敏感細(xì)胞HCT-8及耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR中均有GCS和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),耐藥細(xì)胞株中GCS的表達(dá)高于敏感細(xì)胞株,差異顯著(P0.05);并且Bcl-2在耐藥株中的表達(dá)也明顯高于敏感株細(xì)胞(P0.05),與GCS具有一致性。2.HCT-8/VCR組與HCT-8/VCR+PPMP組相比,加入GCS抑制劑PPMP后,明顯抑制了GCS的表達(dá)(P0.05);同時(shí),在HCT-8/VCR+PPMP組抗凋亡蛋白Bcl-2與ERK蛋白的表達(dá)較HCT-8/VCR組下降(P0.05)。3.RT-q PCR檢測(cè)HCT-8/VCR組與HCT-8組目的基因,結(jié)果顯示:耐藥組細(xì)胞中GCS、Bcl-2及ERK基因都高于其親本細(xì)胞組,且差異顯著(P0.05)。4.HCT-8/VCR組和HCT-8/VCR+PPMP組相比,加入抑制劑組的細(xì)胞內(nèi)GCS m RNA的表達(dá)量明顯低于HCT-8/VCR組(P0.05);加入抑制劑PPMP后,細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和ERK基因的表達(dá)也較耐藥細(xì)胞組明顯下調(diào)(P0.05)。結(jié)論1.在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8及其耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR中,抗凋亡蛋白Bcl-2與GCS的表達(dá)具有一致性。2.GCS通過(guò)影響抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),從而介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞多藥耐藥,這一過(guò)程是通過(guò)ERK信號(hào)通路完成的。3.在細(xì)胞中加入GCS抑制劑PPMP,可以明顯抑制GCS的表達(dá);進(jìn)而使Bcl-2基因及蛋白的表達(dá)水平下調(diào),可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.3

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