本文關(guān)鍵詞：Amotl2表達對肝細胞肝癌EMT和VM形成影響的研究

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【摘要】：【研究目的】肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一種全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,其高發(fā)病率和高致死率的主要原因是血管侵犯和轉(zhuǎn)移。因此對于肝癌轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成的研究將更好地提升肝癌的抗血管治療效果。Amotl2(Angiomotin like protein-2)是Amot家族成員之一,目前仍不清楚Amotl2的作用和分子機制。本實驗檢測肝細胞肝癌中Amotl2、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesencheymal transition,EMT)相關(guān)分子E-cadherin、血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)形成的標記蛋白VE-cadherin的表達情況并探討它們之間的關(guān)系;然后分析Amotl2的表達與年齡、性別、腫瘤大小及臨床分期等各種臨床資料的關(guān)系;探究Amotl2與VM兩者對于肝細胞肝癌(HCC)的生存時間及臨床預(yù)后的影響,從而更好地闡述Amotl2對于肝細胞肝癌VM形成、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的影響和意義。同時在體外實驗中觀察Amotl2對于肝癌細胞的成管、侵襲和遷移能力的影響,進而了解其對于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力及VM形成的影響�？傊�,對于Amotl2在肝細胞肝癌中的表達和VM形成等腫瘤微環(huán)境變化以及臨床預(yù)后的影響的初步研究,將會為肝細胞肝癌的診斷治療尋找到潛在的靶點,為肝細胞肝癌的靶向治療提供一定的借鑒�！狙芯糠椒ā�1、收集天津市腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除且隨訪資料完整并經(jīng)病理診斷為肝細胞肝癌的病例標本89例,利用免疫組織化學(xué)方法染色分析,觀察血管生成擬態(tài)(VM)的存在與否及其與臨床預(yù)后之間的關(guān)系;分析Amotl2與VM、年齡、性別、腫瘤大小、病理分級、臨床分期、轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系;將病例分為原發(fā)性肝癌組(Ⅰ-ⅢA期)、肝癌門脈癌栓組(ⅢB期)和肝癌遠處轉(zhuǎn)移組(ⅣB期),觀察三組之間Amotl2的表達情況以及組間差異與臨床預(yù)后之間的關(guān)系;初步分析上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白(E-cadherin、VE-cadherin)和VM相關(guān)蛋白(CD31/PAS、MMP2)與Amotl2之間的關(guān)系。以及Amotl2陽性、VM陽性對臨床預(yù)后的影響,篩選與VM關(guān)系密切的EMT相關(guān)蛋白,為腫瘤細胞向血管內(nèi)皮方向塑形研究提供依據(jù)。用Kaplan-Meier生存分析比較Amotl2陽性組和Amotl2陰性組患者的生存預(yù)后情況。2、根據(jù)Amotl2的表達水平,選取低表達Amotl2的HCC細胞系Hep G2細胞和高表達Amotl2的HCC細胞系Bel7402細胞。Hep G2細胞轉(zhuǎn)染Amotl2上調(diào)質(zhì)粒構(gòu)建Amotl2上調(diào)模型,Bel7402細胞轉(zhuǎn)染Amotl2下調(diào)質(zhì)粒構(gòu)建Amotl2下調(diào)模型。利用Western Blot鑒定Amotl2轉(zhuǎn)染效果。3、利用劃痕和侵襲實驗評價上調(diào)Amotl2對Hep G2細胞侵襲遷移能力變化的影響;下調(diào)Amotl2對Bel7402細胞侵襲遷移能力變化的影響。4、在三維培養(yǎng)體系中分別上調(diào)Amotl2,觀察其對Hep G2細胞管狀結(jié)構(gòu)形成能力的影響;下調(diào)Amotl2,觀察其對Bel7402細胞管狀結(jié)構(gòu)形成能力的影響。5、利用Western Blot實驗檢測上調(diào)Amotl2對Hep G2細胞中EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、Vimentin)表達的影響;下調(diào)Amotl2對Bel7402細胞中EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、Vimentin)表達的影響。【研究結(jié)果】1、免疫組化染色結(jié)果顯示,在89例肝癌標本中,49例呈Amotl2陽性表達,40例呈Amotl2陰性表達。分析Amotl2陽性組和Amolt2陰性組與肝癌患者臨床病理資料的關(guān)系顯示,Amotl2與VM呈正相關(guān)(c2=5.662,P=0.017)。Amotl2在年齡45歲的患者中表達較高,而在≤45歲的患者中表達較低(c2=8.400,P=0.004)。Amotl2在不同病理分級的患者中表達不同,Amotl2在低分化的患者中表達高于高分化的患者(c2=4.048,P=0.044)。Amotl2在不同臨床分期的患者中表達也不同,肝癌原發(fā)癌組(Ⅰ-ⅢA期)、肝癌門脈瘤栓組(ⅢB期)和肝癌遠處轉(zhuǎn)移組(ⅣB期)三組之間Amotl2的表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(c2=5.575,P=0.019)。Amotl2在不同性別、腫瘤大小、有無轉(zhuǎn)移的患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,Amotl2陽性組較Amotl2陰性組患者的生存時間短(P=0.046)2、統(tǒng)計學(xué)分析表明,Amotl2與肝癌中VM呈正相關(guān),本研究發(fā)現(xiàn),49例Amotl2陽性組中有12例VM陽性,而Amotl2陰性組中僅有4例VM陽性(r=0.277,P=0.009),提示Amotl2與VM密切相關(guān),即Amotl2在VM陽性組的表達率明顯高于在VM陰性組的表達率。本研究發(fā)現(xiàn),49例Amotl2陽性組中有30例VE-cadherin陽性,而Amotl2陰性組中僅有2例VE-cadherin陽性(r=0.631,P=0.000),說明Amotl2與VM相關(guān)蛋白VE-cadherin密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),雖然在89例病例中Amotl2與MMP2關(guān)系不密切,但是在遠處轉(zhuǎn)移組中19例Amotl2陽性組中有10例MMP2陽性,Amotl2陰性組中僅有1例MMP2陽性(r=0.418,P=0.024),兩者關(guān)系密切。3、Western Blot實驗顯示轉(zhuǎn)染Amotl2上調(diào)質(zhì)粒后Hep G2細胞Amotl2表達明顯上調(diào),轉(zhuǎn)染Amotl2下調(diào)質(zhì)粒后Bel7402細胞Amotl2表達明顯下調(diào)。4、劃痕和侵襲實驗結(jié)果顯示,上調(diào)Amotl2后,Hep G2細胞遷移侵襲能力明顯提高(P0.05);下調(diào)Amotl2后,Bel7402細胞遷移侵襲能力明顯降低(P0.05)。5、三維培養(yǎng)結(jié)果顯示,上調(diào)Amotl2后,Hep G2細胞形成管狀結(jié)構(gòu)的能力明顯增強;下調(diào)Amotl2后,Bel7402細胞形成管狀結(jié)構(gòu)的能力明顯降低。6、Western Blot結(jié)果顯示,上調(diào)Amotl2后,Hep G2細胞中EMT相關(guān)蛋白Viementin表達增強,E-cadherin表達降低;下調(diào)Amotl2后,Bel7402細胞中EMT相關(guān)蛋白Viementin表達降低,E-cadherin表達增強。【研究結(jié)論】1、Amotl2表達增加與肝癌的VM、年齡、病理分級、臨床分期呈正相關(guān),與其他臨床病理資料無關(guān),并且Amotl2表達陽性的患者生存時間短,預(yù)后不良。2、Amotl2可以增強HCC細胞的遷移、侵襲能力和VM形成能力,Amotl2基因可能通過誘導(dǎo)HCC細胞發(fā)生EMT來促進肝癌VM形成。本研究可能為肝癌的抗血管治療提供了新的作用靶點。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
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本文編號：1306411