本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞外基質(zhì)蛋白SRPX2對HUVECs血管生成能力的影響

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【摘要】：目的評價(jià)不同來源的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白含sushi重復(fù)蛋白X連鎖2(SRPX2)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)血管生成能力的影響。方法分別用重組pcDNA3.1-SRPX2及空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞和SW480細(xì)胞后收集條件培養(yǎng)基,作用于HUVECs;用pcDNA3.1-SRPX2及空載質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染HUVECs,各部分實(shí)驗(yàn)均分為轉(zhuǎn)染組(添加pcDNA3.1-SRPX2質(zhì)粒)、陰性對照組(添加pcDNA3.1質(zhì)粒)和空白對照組(未添加質(zhì)粒)三組。用Western blot檢測SRPX2蛋白的表達(dá)情況。采用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力。分別用Transwell(共培養(yǎng))遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移能力。用Matrigel基質(zhì)膠體外管腔形成實(shí)驗(yàn)觀察HUVECs管腔形成能力。結(jié)果質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞和SW480細(xì)胞收集條件培養(yǎng)基作用于HUVECs 24、48、72h后,三組各時(shí)間點(diǎn)組間細(xì)胞增殖能力均無明顯差異(p0.05);直接轉(zhuǎn)染HUVECs,轉(zhuǎn)染組24、48、72h各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力較陰性對照組和空白對照組均明顯增強(qiáng)(p0.05)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞收集條件培養(yǎng)基作用于HUVECs,轉(zhuǎn)染組管腔樣結(jié)構(gòu)分支點(diǎn)數(shù)為(97±4)個(gè)/視野,明顯多于陰性對照組(57±3)和空白對照組(54±3)個(gè)/視野(p0.05);質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞收集條件培養(yǎng)基作用于HUVECs,轉(zhuǎn)染組管腔樣結(jié)構(gòu)分支點(diǎn)數(shù)為(86±5)個(gè)/視野,明顯多于陰性對照組(52±3)和空白對照組(51±4)個(gè)/視野(p0.05);質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染HUVECs,轉(zhuǎn)染組管腔樣結(jié)構(gòu)分支點(diǎn)數(shù)為(34±2)個(gè)/視野,明顯多于陰性對照組(15±2)和空白對照組(13±2)個(gè)/視野(p0.05);添加通路抑制劑后SW480條件培養(yǎng)基管腔樣結(jié)構(gòu)分支點(diǎn)數(shù)空白對照組為(12±1)個(gè)/視野、陰性對照組為(11±2)個(gè)/視野、轉(zhuǎn)染組為(26±3)個(gè)/視野、轉(zhuǎn)染后添加uPAR抗體組為(11±2)個(gè)/視野、轉(zhuǎn)染后添加FAK抑制劑組為(0)個(gè)/視野、轉(zhuǎn)染后添加PI3K抑制劑組為(10±3)個(gè)/視野、轉(zhuǎn)染后添加MAPK抑制劑組為(15±2)個(gè)/視野、轉(zhuǎn)染后添加DMSO組為(23±1)個(gè)/視野,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞收集條件培養(yǎng)基作用于HUVECs,轉(zhuǎn)染組劃痕6和12 h細(xì)胞遷移距離均明顯大于陰性對照組和空白對照組,分別為(89.72±5.70)、(37.14±6.81)和(35.87±4.28)μm,(135.38±4.95)、(65.00±8.02)和(63.11±3.79)μm,(P0.05);質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞收集條件培養(yǎng)基作用于HUVECs,轉(zhuǎn)染組劃痕6和12h細(xì)胞遷移的距離均明顯大于陰性對照組和空白對照組分別為(86.78±6.81)、(38.54±6.32)和(34.00±4.28)μm,(129.34±4.43)、(63.10±7.62)和(57.11±2.99)μm,(p0.05);質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染HUVECs,轉(zhuǎn)染組劃痕6和12 h細(xì)胞遷移距離均明顯大于陰性對照組和空白對照組,分別為(108.32±8.41)、(69.97±9.23)和(64.87±7.34)μm,(155.87±5.34)、(121.19±8.03)和(118.89±5.24)μm(p0.05)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,Transwell共培養(yǎng)遷移實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染組16h遷移過膜細(xì)胞數(shù)為(549±10)個(gè)/視野,明顯高于陰性對照組(334±11)和空白對照組(329±12)個(gè)/視野(p0.05);質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞,Transwell共培養(yǎng)遷移實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染組16h遷移過膜細(xì)胞數(shù)為(512±12)個(gè)/視野,明顯高于陰性對照組(318±11)和空白對照組(300±10)個(gè)/視野(P0.05);直接轉(zhuǎn)染HUVECs遷移實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)染組16h遷移過膜細(xì)胞數(shù)為(586±30)個(gè)/視野,明顯高于陰性對照組(300±16)和空白對照組(290±21)個(gè)/視野(p0.05)。結(jié)論不同來源的SRPX2均可通過促進(jìn)HUVECs的遷移及在Matrigel表面的管腔形成能力。提高內(nèi)源性SRPX2的表達(dá)可促進(jìn)HUVECs增殖能力,而來源于HEK293T細(xì)胞和SW480細(xì)胞的SRPX2對HUVECs增殖能力無明顯影響。添加uPAR抗體、FAK、PI3K和MAPK通路抑制劑后,HUVECs的管腔形成能力明顯減弱,提示SRPX2促進(jìn)腫瘤血管生成可能與這些通路相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5

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