本文關(guān)鍵詞：可溶性TRAIL的表達、純化及其對三種大腸癌細胞作用的初步分析

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【摘要】：目的:1.表達并純化較高活性的TRAIL蛋白,優(yōu)化表達條件。2.觀察TRAIL對大腸癌細胞HCT116、SW480和SW620細胞增殖的影響,并對機制進行初步分析。方法:1.TRAIL的表達與純化。擴大培養(yǎng)含p ET-d-TRAIL質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a,IPTG誘導(dǎo)表達TRAIL蛋白。表達產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和層析和離子交換層析純化。利用MTT法測定純化產(chǎn)物對大腸癌細胞SW480增殖的影響。分別改變誘導(dǎo)劑IPTG的濃度和誘導(dǎo)時間,從而確定誘導(dǎo)TRAIL的最適條件。在親和層析過程中采用兩種洗脫TRAIL的方式,并改變透析的時間,對比以上條件對TRAIL活性的影響。2.初步分析TRAIL對HCT116、SW480和SW620的增殖的影響。在HCT116、SW480和SW620三種大腸癌細胞中分別加入0、100、200和400mg/ml的TRAIL,培養(yǎng)12 h后,光鏡下觀察TRAIL對細胞形態(tài)的影響;MTT法測定TRAIL對細胞增殖的影響;用western blot檢測三種細胞中DR5、caspase-3、caspase-6、caspase-7、caspase-8和XIAP的蛋白表達水平;轉(zhuǎn)染caspase-8質(zhì)粒至SW620細胞,進一步觀察高表達caspase-8的SW620細胞對TRAIL敏感性。結(jié)果:1.確定最適誘導(dǎo)條件:TRAIL工程菌在培養(yǎng)4 h后進入對數(shù)生長期,在IPTG濃度為0.5 mmol/L條件下37℃誘導(dǎo)6 h,TRAIL的蛋白表達量占總蛋白的比例達到20%。2.純化出純度高于95%的可溶性TRAIL蛋白。3.在細胞生長處于對數(shù)生長期時分別加入0、100、200和400mg/ml的TRAIL并培養(yǎng)12 h。MTT實驗顯示HCT116的細胞活力分別為對照組的65%、28%、6%。SW480細胞的活力分別為對照組的85%、65%、42%。SW620的細胞活力分別為對照組的95%、94%、91%。4.Western blot顯示HCT116、SW480、SW620中caspase-3、caspase-6、caspase-7和caspase-8的蛋白表達量逐漸降低,DR5的蛋白表達量則逐漸升高,XIAP的表達水平從高到低則依次為SW480、SW620和HCT116。5.SW620細胞轉(zhuǎn)染caspase-8后,在100mg/ml TRAIL作用下,細胞活力降低了33%。結(jié)論:1.TRAIL能抑制三種大腸癌細胞的增殖,其抑制效應(yīng)呈濃度依賴關(guān)系。2.三種細胞對TRAIL有不同程度的敏感性。SW620對TRAIL最不敏感;HCT116對TRAIL最敏感;SW480為中度敏感。3.SW620對TRAIL的耐受性可能與caspase-8的表達水平低有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

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1 楊濤;楊利軍;張建林;張悅紅;牛勃;;抗TNFα單鏈抗體在大腸桿菌中可溶性表達條件的研究[J];藥物生物技術(shù);2010年06期

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本文編號：1303289