本文關(guān)鍵詞：KLF4在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)及其作用研究

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【摘要】：目的:在前期工作研究中,我們通過臨床病理研究發(fā)現(xiàn),Krüppel樣因子4(KLF4)在食管鱗癌中呈低表達(dá),而在正常食管粘膜中呈高表達(dá),其表達(dá)與食管鱗癌的分期及患者的預(yù)后密切相關(guān)。另外,通過甲基化特異性PCR、Western blot檢測食管鱗癌細(xì)胞系:CAES17、EC109、KYSE-140、KYSE-70和KYSE-30中KLF4相對高表達(dá),TE1和KYSE-510中KLF4相對低表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),KLF4在KYSE140細(xì)胞系中呈低甲基化高表達(dá),而在TE1中呈高甲基化低表達(dá)。本課題主要是通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步研究KLF4在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)及其作用,并探討其對PI3K/AKT信號通路的影響。目的是初步探討KLF4在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制,為今后以KLF4為靶基因的食管鱗癌的基因治療提供依據(jù)。方法:1、構(gòu)建以慢病毒為載體的靶向KLF4 RNA干擾(LV-shKLF4-A~C)的表達(dá)載體,通過熒光、RT-PCR、Western blot篩選出干擾效率最高的一組(選擇最佳干擾序列)。構(gòu)建以慢病毒為載體的包含KLF4全長表達(dá)(LV-KLF4)載體,轉(zhuǎn)染并篩選出穩(wěn)定傳代的食管癌細(xì)胞系。通過測序、熒光、RT-PCR、Western blot法驗(yàn)證慢病毒載體是否構(gòu)建成功。2、將LV-sh KLF4-C及LV-KLF4分別轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的KYSE140細(xì)胞系和TE1細(xì)胞系,通過Western blot檢測KYSE140細(xì)胞RNA干擾前后KLF4蛋白的表達(dá)水平及TE1細(xì)胞過表達(dá)前后KLF4蛋白的表達(dá)水平;通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測KYSE140細(xì)胞RNA干擾前后的遷移能力及TE1細(xì)胞過表達(dá)前后的遷移能力;通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測KYSE140細(xì)胞RNA干擾前后的侵襲能力及TE1細(xì)胞過表達(dá)前后的侵襲能力;MTT實(shí)驗(yàn)檢測檢測KYSE140細(xì)胞RNA干擾前后的增殖能力及TE1細(xì)胞過表達(dá)前后的的增殖能力。3、通過Western blot檢測檢測KYSE140細(xì)胞RNA干擾前后的P-AKT、AKT蛋白的表達(dá)水平及TE1細(xì)胞過表達(dá)前后的P-AKT、AKT蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1、以慢病毒為載體的靶向KLF4 RNA干擾(LV-sh KLF4-C)及包含KLF4全長表達(dá)載體(LV-KLF4)構(gòu)建成功,其中LV-sh KLF4-C組的干擾效率最高。2、Western blot檢測LV-sh KLF4-C組中KLF4的蛋白表達(dá)水平較空白對照組、空載對照組降低,LV-KLF4組中KLF4的蛋白表達(dá)水平較空白對照組、空載對照組升高;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LV-sh KLF4-C組的遷移能力較空白對照組、空載對照組升高,LV-KLF4組的遷移能力較空白對照組、空載對照組降低;通過Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LV-sh KLF4-C組的侵襲能力較空白對照組、空載對照組升高;LV-KLF4組中的侵襲能力較空白對照組、空載對照降低;通過MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LV-sh KLF4-C組的增殖能力較空白對照組、空載對照組升高,LV-KLF4組的增殖能力較空白對照組、空載對照組降低�？瞻讓φ战M與空載對照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:KLF4蛋白的表達(dá)與食管鱗癌細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖能力呈負(fù)相關(guān)。3、Western blot檢測:LV-sh KLF4-C組中P-AKT的蛋白表達(dá)水平較空白對照組、空載對照組升高;LV-KLF4組中P-AKT的蛋白表達(dá)水平較空白對照組、空載對照組降低,AKT表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:1、成功構(gòu)建了以慢病毒為載體的靶向KLF4 RNA干擾(LV-shKLF4-A~C)及包含KLF4全長表達(dá)(LV-KLF4)的過表達(dá)慢病毒載體。2、KLF4對食管癌細(xì)胞系的遷移、侵襲、增殖有一定的影響,在食管鱗癌細(xì)胞中,起抑癌作用。3、食管鱗癌細(xì)胞系中,KLF4的表達(dá)可影響PI3K/Akt信號通路。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1
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本文編號：1298120