本文關(guān)鍵詞：幾種AML細胞株的生物學特征及Kasumi-1細胞耐藥逆轉(zhuǎn)機制研究

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【摘要】：背景與目的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是發(fā)生于血液系統(tǒng)造血干/祖細胞的惡性增殖性疾病,主要以大量的髓系白血病細胞在骨髓中惡性增殖、積聚,抑制正常造血功能為特征。白血病是當今嚴重威脅人類健康的惡性血液系統(tǒng)疾病,其發(fā)生率及死亡率呈逐漸上升趨勢,我國腫瘤登記地區(qū)2003-2007年白血病的發(fā)病率和死亡率分別為5.17/10萬、3.94/10萬,新發(fā)例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全部惡性腫瘤的1.94%、2.29%,在全部惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率分別居第13位和第9位,而2009年我國腫瘤地區(qū)登記白血病發(fā)病及死亡情況的數(shù)據(jù)分析顯示,我國白血病的年發(fā)生率約為5.68/10萬,占全惡性腫瘤發(fā)病的1.99%,死亡率約4.28/10萬,占全部惡性腫瘤死亡例數(shù)的2.37%,發(fā)病率和死亡率均稍上升。當前隨著化療方案的不斷改進,50～85%的患者經(jīng)標準方案誘導(dǎo)化療可獲得骨髓完全緩解(complete remission,CR),但復(fù)發(fā)率仍高達30～40%,而不少患者甚至難以獲得初治的誘導(dǎo)緩解,究其原因,白血病細胞對化療藥物產(chǎn)生原發(fā)性或繼發(fā)性多藥耐藥現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗和復(fù)發(fā)的主要因素。如同惡性實體腫瘤細胞對化療藥物耐藥,白血病細胞對化療藥物耐藥也是一個多因素參與、多步驟完成的復(fù)雜過程,過表達耐藥基因(如MDRl、MRP1、BCRP、LRP、GSTP1、DHFR)、基因突變(如FLT3、MLL基因等)、骨髓微環(huán)境的影響等均可導(dǎo)致白血病細胞對化療藥物耐藥。本課題組的臨床研究發(fā)現(xiàn)AML1/ETO+ AML患者中高表達淀粉樣前體蛋白(APP)基因者誘導(dǎo)緩解率及預(yù)后較低表達APP者差,相關(guān)研究報道卵巢癌、胰腺癌及肝癌細胞對化療藥物耐藥與腫瘤細胞過表達果蠅zeste基因增強子的人類同源基因(EZH2)相關(guān),因此,我們推測：APP及EZH2基因可能與AML1/ETO+ AML細胞對化療藥物的耐藥性相關(guān),但尚未見APP基因及EZH2基因高表達與白血病細胞耐藥的關(guān)系及機制的研究報道。同時,本課題組的前期實驗研究發(fā)現(xiàn),急性髓系白血病細胞株Kasumi-1細胞具有AML1/ETO+并高表達APP和EZH2基因的特征,沉默Kasumi-1細胞的APP及EZH2基因后細胞的遷移能力下降。本課題在此基礎(chǔ)上,以Kasumi-1細胞為主要研究對象,檢測其基本的生物學特性及對常用化療藥物的敏感性,并研究APP、EZH2基因在Kasumi-1細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥中的作用,為尋找提高白血病對化療藥物敏感性的靶向藥物提供理論依據(jù)。t(8；21)是AML中最常見的染色體異常,由8號和21號染色體異位生成AML1-ETO融合基因,在成人AML中的發(fā)生率為4-12%,而在兒童AML中的發(fā)生率則高達12-30%。AML1-ETO融合基因陽性的白血病在某種程度上表現(xiàn)髓系分化,因此將其歸類至FAB分型中的M2亞型。人類和小鼠AML模型均證實了AML1-ETO融合基因與酪氨酸激酶突變、過表達WT1、ICSBP和P21基因缺失等二次事件共同促進白血病的發(fā)生和發(fā)展。AML1/ETO+ AML患者的誘導(dǎo)治療方案仍為傳統(tǒng)的由蒽環(huán)類藥物和阿糖胞苷組成的“3+7”方案,獲得誘導(dǎo)緩解后給予高劑量阿糖胞苷鞏固化療。盡管t(8；21)是一個預(yù)后良好的因素,大部分患者經(jīng)誘導(dǎo)治療和鞏固化療后可獲得完全緩解,但是該類型患者的5年生存率僅約50%,伴隨c-kit突變的患者預(yù)后則更差。本課題組前期的臨床研究也發(fā)現(xiàn),／AML1/ETO+ AML患者中高表達淀粉樣前體蛋白(APP)基因者預(yù)后不佳,這提示APP可能為預(yù)后不良因素。淀粉樣前體蛋白(APP)屬Ⅰ型跨膜蛋白,廣泛表達于各種類型細胞中,具有調(diào)控細胞的生長及凋亡,參與基因轉(zhuǎn)錄、鈣離子平衡調(diào)節(jié)等生物學功能。APP基因在胰腺癌、口腔鱗狀上皮細胞癌、大腸癌等多種實體腫瘤中表達增高,且可促進胰腺癌、口腔鱗狀上皮細胞癌和大腸癌細胞的增殖。本課題組曾報道,AML各亞型中APP mRNA在AML1/ETO+AML患者的表達最高,APP基因高表達與白血病的遷移和髓外浸潤有關(guān),但尚未見APP基因的表達水平與化療藥物敏感性關(guān)系的報道。果蠅zeste基因增強子的人類同源基因(EZH2)是PeG蛋白家族的重要成員之一,也是核心蛋白復(fù)合體2(PRC2)的催化亞基,具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性,它通過對組蛋白H3K27位點賴氨酸進行甲基化修飾發(fā)揮沉默靶基因作用而促進腫瘤生成。多種惡性腫瘤高表達EZH2,如前列腺癌、乳腺癌等,EZH2通過促進腫瘤細胞的增殖、增強細胞遷移和侵襲能力、阻滯細胞周期而參與腫瘤的發(fā)生與演進,多種實體瘤異常表達EZH2基因與腫瘤侵襲性及較差預(yù)后相關(guān),已有研究證實EZH2蛋白與卵巢癌、胰腺癌、肝癌細胞對化療藥耐藥相關(guān),但尚未見其與白血病細胞耐藥的相關(guān)研究報道。Kasumi-1、HL-60及HL-60/ADM細胞株均屬髓系細胞株,是血液病科研實驗中常用的細胞株,然而,關(guān)于這三株細胞生物學特性的研究甚少。因此,本課題以AML細胞株為研究對象,采用細胞形態(tài)學、流式細胞免疫分型、染色體核型分析、熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)并結(jié)合DNA測序方法檢測Kasumi-1、HL-60、HL-60/ADM細胞的基本生物學特性,并分別采用qRT-PCR和Western Blot的方法檢測3株細胞的APP、EZH2 mRNA和蛋白表達量。用MTT法檢測Kasumi-1、HL-60、HL-60/ADM細胞對Ara-c、HHT、 ADM、DNR、IDA的敏感性,經(jīng)慢病毒分別轉(zhuǎn)染si-APP、si-EZH2序列至Kasumi-1細胞沉默APP、EZH2基因后,MTT法檢測沉默后Kasumi-1細胞對藥物的敏感性,并進一步研究APP、EZH2基因在Kasumi-1細胞對化療藥物耐藥的機制中的作用。對象與方法1.AML細胞株的生物學特性鑒定采用細胞形態(tài)學、流式細胞免疫分型(FCM)、染色體核型分析、熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)并結(jié)合DNA測序方法檢測Kasumi-1、 HL-60、HL-60/ADM細胞的生物學特性。應(yīng)用qRT-PCR方法檢測HL-60、 HL-60/ADM、Kasumi-1細胞的APPmRNA及 EZH2 mRNA的表達水平,WesternBlot方法檢測HL-60、HL-60/ADM、Kasumi-1細胞的APP及EZH2蛋白表達水平。2.HL-60、HL-60/ADM、Kasumi-1細胞對常用化療藥物的敏感性檢測四唑鹽(MTT)比色法分別檢測不同濃度的Ara-c、HHT、ADM、DNR、IDA對HL-60、HL-60/ADM、Kasumi-1細胞的增殖抑制率,利用IC50計算軟件計算各藥物對各細胞株的IC50,并計算耐藥倍數(shù)(RI),IC50 (HL-60/ADM)/ IC50 (HL-60)的比值為HL-60/AD M細胞的RI,RI30說明HL-60/ADM是耐藥株,HL-60細胞株是敏感株,可以作為本研究的對照細胞株；IC50 (Kasumi-1) /IC50 (HL-60)的比值為Kasumi-1細胞的RI,RI30說明Kasumi-1細胞對該化療藥物耐藥。3.沉默Kasumi-1細胞的APP或EZH2基因?qū)ra-c、ADM的耐藥逆轉(zhuǎn)作用由本課題組其他成員轉(zhuǎn)染空病毒及攜帶沉默APP、EZH2基因序列的病毒至Kasumi-1細胞后,獲得NC-Kasumi-1、si-APP Kasumi-1、si-EZH2 Kasumi-1細胞。采用MTT法分別檢測不同濃度的Ara-c、ADM對NC-Kasumi-1、si-APP Kasumi-1、si-EZH2 Kasumi-1細胞的增殖抑制率,利用IC50計算軟件計算各藥物對各細胞株的IC50,分別比較各藥物對NC-Kasumi-1與si-APP Kasumi-1、 si-EZH2 Kasumi-1的增殖抑制率的差異,并計算逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)(RF),IC50 (Kasumi-1)/IC50 (si-Kasumi-1)比值為si-Kasumi-1細胞的RF, RF1說明沉默APP/EZH2基因后Kasumi-1細胞對化療藥物的敏感性增加。4.耐藥逆轉(zhuǎn)的信號蛋白檢測qRT-PCR檢測Kasumi-1. si-APP Kasumi-1、si-EZH2 Kasumi-1細胞MDR1mRNA的表達量,Western Blot檢測Kasumi-1、si-EZH2 Kasumi-1細胞Hedgehog通路中Gli-1蛋白的表達量。5.統(tǒng)計分析方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,每次實驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)資料以x±S描述。均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),方差齊使用LSD方法進行多重比較,方差不齊則使用采用近似F檢驗(Welch方法)代替方差分析后采用Dunnett's T3方法進行多重比較。以p0.05認為具有統(tǒng)計學差異。結(jié)果1.AML細胞株的生物學特性比較形態(tài)學及細胞免疫表型結(jié)果均顯示Kasumi-1細胞、HL-60細胞、HL-60/ADM細胞均屬于髓系白血病細胞株,染色體核型分析顯示三株細胞的染色體均為復(fù)雜核型,Kasumi-1細胞伴t(8；21)核型特征。FISH和qRT-PCR檢測的結(jié)果均顯示Kasumi-1細胞表達AML1/E TO融合基因,DNA測序顯示Kasumi-1細胞KIT基因突變陽性,NPM1、FLT3-ITD及DNMT3AR882突變陰性,HL-60、HL-60/ADM細胞KIT、NPM1、FLT3-ITD及DNMT3AR882突變均為陰性。2.APP及EZH2基因表達水平比較(1)所有進行qRT-PCR樣本的A260/A280比值均在1.80-2.00之間,說明RNA純度滿足實驗要求。目的基因和內(nèi)參基因的熔解曲線均顯示單一峰,表明cDNA的解鏈溫度均一致,且曲線峰形銳利,提示引物的特異性較高；擴增曲線的重合性及平行性較好,表明實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠。(2)qRT-PCR結(jié)果顯示：H IL-60、HL-60/ADM、Kasumi-1細胞的APPmRNA表達量分別為0.142±0.049、0.053±0.009、0.171±0.065, Kasumi-1細胞與HL-60細胞無明顯差異(p=0.413),但明顯高于HL-60/ADM細胞(P=0.004)；HL-60、HL-60/ADM. Kasumi-1細胞的EZH2mRNA表達量分別為0.136±0.033、0.121±0.019、0.114±0.015,三者EZH2mRNA表達量無明顯差異(P0.05)。(3) Western-Blot檢測結(jié)果顯示內(nèi)參蛋白GAPDH表達量一致,內(nèi)參蛋白及目的蛋白條帶清晰,說明Western-Blot結(jié)果穩(wěn)定可靠。結(jié)果顯示Kasumi-1細胞APP蛋白表達量與HL-60無顯著差異,但較HL-60/ADM細胞高,三株細胞EZH2蛋白的表達無明顯差異。3.HL-60、HL-60/ADM、Kasumi-1細胞株對常用化療藥物的敏感性比較Ara-c、ADM、DNR、IDA、HH T對HL-60、HL-60/ADM、Kasumi-1細胞的增殖抑制作用均呈劑量依賴效應(yīng),化療藥物對細胞的增殖抑制率隨著藥物劑量增加而增加;HL-60/ADM對5種化療藥物的耐藥倍數(shù)均大于30,說明HL-60對5種化療藥物均敏感,]HL-60/ADM對5種化療藥物均耐藥;Kasumi-1細胞對Ara-c、ADM、DNR、IDA、HHT的耐藥倍數(shù)分別為1548、31、15、11、0.27,根據(jù)耐藥判斷標準,Kasumi-1細胞對Ara-c、ADM耐藥。4. si-APP Kasumi-1、si-EZH2 Kasum i-1細胞對Ara-c、ADM的敏感性Ara-c、ADM對NC-Kasumi-1、si-APP Kasumi-1、si-EZH2 Kasumi-1細胞的增殖抑制作用亦呈劑量依賴效應(yīng),化療藥物對細胞的增殖抑制率隨著藥物劑量增加而增加；Ara-c對NC-Kasumi-1、Kasumi-1的增殖抑制率及ADM對NC-Kasumi-1、Kasumi-1的增殖抑制率均無顯著性差異,說明轉(zhuǎn)染病毒對細胞的增殖無明顯影響。si-APP Kasumi-1細胞對Ara-c、ADM的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RF)分別為1.4.0.28,si-EZH2 Kasumi-1細胞對Ara-c、ADM的RF分別為59.35、64.03,說明沉默EZH2基因后Kasumi-1細胞對Ara-c ADM的敏感性均明顯增加,而沉默APP基因后僅能部分增加Kasumi-1細胞對Ara-c的敏感性。5. si-EZH2 Kasumi-1細胞逆轉(zhuǎn)耐藥的機制Kasumi-1細胞的MDR1mRNA的表達量明顯高于si-EZH2 Kasumi-1細胞(p=0.001),而與si-APP Kasumi-1細胞的MDR1mRNA表達量比較則沒有統(tǒng)計學差異(p=0.307),si-EZH2 Kasumi-1細胞Gli-1蛋白的表達量也明顯低于Kasumi-1細胞(p0.001)。結(jié)論Kasumi-1、HL-60、HL-60/ADM細胞均表現(xiàn)髓系原始細胞的形態(tài)學特征,并表達髓系細胞表面抗原,染色體均為復(fù)雜核型,僅有Kasumi-1細胞伴t(8；21)和AML1/ETO融合基因陽性及KIT基因突變陽性。Kasumi-1細胞APPmRNA及蛋白的表達量與HL-60細胞均無顯著差異,但均顯著高于及FIL-60/ADM細胞,EZH2mRNA及蛋白的表達量在三株細胞中無顯著性差異。Kasumi-1細胞在體外對Ara-c及ADM耐藥,而對DNR相對敏感,對HHT及IDA最敏感。沉默APP基因的表達僅僅可以部分逆轉(zhuǎn)對Ara-c的耐藥,而沉默EZH2基因的表達能夠明顯逆轉(zhuǎn)Kasumi-1細胞對Ara-c、ADM的耐藥性,并伴隨著MDR1mRNA及Hedgehog通路Gli-1蛋白表達量明顯下降。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 石源源;賈玉平;紀靜;趙真真;韓璐;羅兵;;EBV陽性胃癌細胞系與陰性胃癌細胞系全基因組表達譜差異比較（英文）[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2015年20期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 蔣玲;APP基因調(diào)控AML1/ETO~+白血病細胞遷移及其分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2013年

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本文編號：1298113