本文關(guān)鍵詞：5，6-二羥基-3，，7，4’-三甲氧基黃酮醇化合物的抗肝癌活性及機(jī)制研究

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【摘要】：目前,惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的因素之一,其中肝癌的發(fā)病率及致死率更是呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。癌癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其預(yù)防與治療一直備受關(guān)注,而在臨床上腫瘤耐藥更是化療失敗的罪魁禍?zhǔn)?尋找新型抗癌藥物是新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。天然產(chǎn)物一直是癌癥治療先導(dǎo)化合物的重要來源。本課題研究的對(duì)象——化合物5,6-二羥基-3,7,4'-三甲氧基黃酮醇(AH5表示)就是從傳統(tǒng)中藥須彌紫菀中提取得到的一種黃酮類化合物。在本論文中,我們從抗腫瘤活性及細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制兩方面對(duì)AH5進(jìn)行系統(tǒng)研究。首先,MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明該化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長有抑制作用,尤其對(duì)肝癌細(xì)胞作用最明顯,而對(duì)正常細(xì)胞毒性很小,對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制具有時(shí)間和劑量依賴性。不同濃度AH5作用細(xì)胞12 h,顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞有明顯的G2/M周期阻滯現(xiàn)象。繼續(xù)作用24小時(shí),顯微鏡下觀察到細(xì)胞皺縮,核裂解,細(xì)胞膜出現(xiàn)小泡狀包裹細(xì)胞碎片,用凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡狀態(tài)。DAPI染色進(jìn)一步驗(yàn)證了凋亡小體的形成。Western blot蛋白免疫印跡法檢測(cè)了經(jīng)AH5處理的HepG2田胞中周期相關(guān)蛋白及caspases凋亡蛋白的表達(dá)變化。AH5降低cyclin B1的表達(dá),上調(diào)p-cdc2蛋白水平,表明AH5能夠降低復(fù)合物cyclin B/cdc2的活性,使細(xì)胞阻滯在G2/M期。AH5作用的細(xì)胞中caspases-3,9的活化形式增加,這也標(biāo)志著細(xì)胞凋亡的發(fā)生。以上結(jié)果表明,AH5具有誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M阻滯和凋亡的抗腫瘤活性。我們進(jìn)一步研究AH5對(duì)HepG2細(xì)胞作用的分子機(jī)制。前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)AH5對(duì)HepG2(p53野生型)的作用敏感于其他肝癌細(xì)胞。Western blot和RT-PCR法檢測(cè)到p53及其調(diào)控細(xì)胞周期的下游靶基因p21在蛋白和基因表達(dá)水平都明顯升高。而PFT-α(p53轉(zhuǎn)錄特異性抑制劑)對(duì)AH5誘導(dǎo)的周期阻滯有明顯抑制作用。RT-PCR結(jié)果表明,p53及下游基因Bax的表達(dá)也增加。我們的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)AH5誘導(dǎo)的凋亡機(jī)制與線粒體介導(dǎo)的途徑有關(guān)。結(jié)果顯示AH5處理細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)明顯的線粒體膜電勢(shì)降低和細(xì)胞色素C釋放,激活caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)凋亡。有文獻(xiàn)報(bào)道,細(xì)胞的應(yīng)激作用能誘導(dǎo)p53在細(xì)胞質(zhì)中的累積,直接導(dǎo)致Bax寡聚化,進(jìn)而誘發(fā)線粒體途徑的凋亡。免疫熒光染色和蛋白質(zhì)印跡分析亞細(xì)胞成分的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了p53轉(zhuǎn)錄非依賴線粒體途徑參與了AH5誘導(dǎo)的凋亡。抑制劑PFT-α和PFT-μ部分逆轉(zhuǎn)了AH5誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率下降,線粒體膜電勢(shì)降低及凋亡作用,證實(shí)p53轉(zhuǎn)錄依賴和非依賴途徑都包括在AH5誘導(dǎo)的凋亡機(jī)制中。綜上結(jié)果表明,AH5具有明顯的抗腫瘤活性。通過激活p53調(diào)控下游p21的表達(dá),誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞阻滯在G2/M期。AH5激活HepG2細(xì)胞中p53信號(hào)通路,通過轉(zhuǎn)錄依賴和非依賴途徑調(diào)節(jié)Bax的表達(dá)和聚集形式,誘發(fā)線粒體途徑凋亡。AH5作為一種潛在的抗腫瘤新藥值得更進(jìn)一步的深入研究。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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