發(fā)布時間：2017-12-16 13:21

  本文關(guān)鍵詞：microRNA-320d下調(diào)靶基因CDK6抑制人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞增殖、侵襲的作用機制的研究

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【摘要】：目的:探討CDK6基因的表達與彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)臨床病理特征之間的關(guān)系,驗證hsa-micro RNA-320d(mi R-320d)靶向調(diào)控CDK6對DLBCL細胞增殖的影響及分子機制。方法:(1)從被診斷為彌漫大B細胞淋巴瘤的病例中,我們收集庫存于病理科檔案室的患者石蠟樣本84例,和詳細的隨訪資料,同時采用免疫組化En Vision兩步法對所收集的樣本進行CDK6免疫標記同時驗證其表達水平。(2)利用三種生物信息學(xué)軟件(mi RDB,mi Randa,Targetscan)預(yù)測與mi R-320d的3’UTR端特異性結(jié)合的靶基因,螢火蟲熒光素酶活性則采用雙熒光素酶報告測定法去檢測,同時驗證靶基因CDK6的3’UTR和mi R-320d的相互作用。(3)在構(gòu)建CDK6-sh RNA的慢病毒載體的基礎(chǔ)上選用成熟mi RNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染DLBCL細胞株。(4)CCK-8法和Annexin V-APC/7-AAD法檢測mi R-320d穩(wěn)定過表達和干擾CDK6對DLBCL細胞增殖和凋亡的影響。(5)分別提取DLBCL組、mi R-320d過表達組及對照組三組的總蛋白,同時采用Western blotting技術(shù)來檢測CDK6蛋白的表達水平。結(jié)果:(1)DLBCL患者組中CDK6基因的表達相較于濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma,FL)陰性對照組顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)成功篩選并預(yù)測出CDK6為mi R-320d的靶基因之一。CDK6 3’UTR與mi R-320d的特異性結(jié)合通過雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光素酶檢測得以證實。(3)敲低CDK6和mi R-320d過表達的慢病毒載體被成功構(gòu)建。相較于對照組,mi R-320d過表達組DLBCL細胞增殖能力降低,CDK6敲低組DLBCL細胞增殖降低,這些均通過細胞增殖試驗得以證實,同時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。細胞凋亡試驗尚未證實CDK6干擾組與mi R-320d過表達組對DLBCL細胞凋亡率的影響是否有顯著差異。(4)采用DLBCL細胞株分別轉(zhuǎn)染mi R-320d過表達慢病毒載體與通用載體,并運用Western blotting法驗證兩者的數(shù)據(jù)結(jié)果。mi R-320d過表達組中CDK6蛋白表達相對低于對照組(0.04±0.04/0.87±0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。mi R-320d可能影響和調(diào)控DLBCL細胞中CDK6基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)論:CDK6蛋白在人DLBCL中高度表達,提示CDK6可能作為癌基因,成為導(dǎo)致DLBCL高致死率及預(yù)后欠佳的主要因素之一。mi R-320d作用于基因的3’UTR,提示CDK6是mi R-320d直接調(diào)控的靶基因;鑒于mi R-320d對DLBCL細胞增殖能力可通過靶向調(diào)控CDK6來抑制的特性,可將CDK6視作判斷DLBCL預(yù)后的潛在指標之一,同時CDK6也是DLBCL生物實驗治療的研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.1

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1 徐夢微;microRNA-320d下調(diào)靶基因CDK6抑制人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞增殖、侵襲的作用機制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號：1296173