本文關(guān)鍵詞：非小細胞肺癌細胞及其順鉑耐藥細胞株DNA和組蛋白表觀遺傳差異的研究

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【摘要】：目的:探討非小細胞肺癌及其順鉑耐藥細胞株DNA和組蛋白的表觀遺傳學差異。方法:選取野生型非小細胞肺癌細胞株A549和H838細胞株,采用逐漸增加順鉑濃度并大劑量沖擊相結(jié)合的方法誘導非小細胞肺癌細胞株的耐藥細胞群,誘導后繼續(xù)在正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)21天,分別在誘導后第1天、6天、11天、16天和21天,收細胞提取DNA、RNA和蛋白,行如下檢測:(1)MSP研究DNMT1基因和DNMT3b基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài);(2)染色體免疫共沉淀(ChIP)研究DNMT1基因、DNMT3b基因、H3K4Me2和H3K9Me2的關(guān)系;(3)Infinium研究基因組甲基化狀態(tài),根據(jù)甲基化變化適當調(diào)整檢查的時間點;(4)熒光定量PCR(qRT-PCR)研究DNMT1、DNMT3b和MDR1的m RNA表達;(5)流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期和凋亡;(6)Western blotting檢測DNMT1、DNMT3b和MDR1蛋白表達,其中DNMT1和DNMT3b的表達包括全細胞、胞漿、胞核內(nèi)游離蛋白和結(jié)合于染色體的蛋白;(7)CCK-8檢測細胞生長活性。結(jié)果:1.兩株非小細胞肺癌細胞株經(jīng)30周順鉑誘導,最終可于目標順鉑濃度2.0ug/ml的培養(yǎng)液中穩(wěn)定增殖,表明細胞株順鉑耐藥誘導成功。2.順鉑耐藥細胞株脫離順鉑培養(yǎng)后在不同的時間點收集樣本檢測發(fā)現(xiàn),隨著去藥物培養(yǎng)時間的增加,Western blotting,qRT-PCR,ChIP,MSP,Infinium,DNMT1、DNMT3b基因甲基化水平降低,使該基因mRNA,蛋白,組蛋白以及整體基因組甲基化水平表達均出現(xiàn)先遞減后遞增的一致趨勢,并且能導致細胞周期阻滯,細胞增殖能力亦可先減弱后增強。結(jié)論:1.非小細胞肺癌細胞株經(jīng)誘導順鉑耐藥后,能逆轉(zhuǎn)DNMT1、DNMT3b甲基化狀態(tài),進一步說明表觀遺傳可以逆轉(zhuǎn)的性質(zhì),為臨床長期進行表觀遺傳治療提供依據(jù)。2.非小細胞肺癌順鉑耐藥細胞株DNMT1、DNMT3b基因的mRNA、蛋白表達趨勢和在細胞周期的不同時間點出現(xiàn)周期阻滯與這兩個基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)有著較為密切的聯(lián)系,表明表觀治療藥物對DNMT1、DNMT3b的抑制作用主要體現(xiàn)在抑制其生成。3.DNMT1、DNMT3b基因可能是非小細胞肺癌順鉑耐藥發(fā)生、發(fā)展中的一個重要因素,為非小細胞肺癌的表觀遺傳學的分子靶向治療提供新途徑。
【學位授予單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：1290943