發(fā)布時(shí)間：2017-12-15 03:15

  本文關(guān)鍵詞：miR-450a-5p在漿液性卵巢癌中的表達(dá)及功能初步研究

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【摘要】：研究背景:上皮性卵巢癌是婦科最致命的惡性腫瘤,占所有卵巢癌75%~90%,其中漿液性卵巢癌又占全部上皮性卵巢癌的60%~70%。因早期階段的卵巢癌無(wú)明顯可察覺(jué)癥狀及體征,并且目前缺少有效的早期診斷及早期治療手段,故70%以上病人就診時(shí)已屬晚期,平均5年生存率低于30%,死亡率居所有女性生殖道癌癥的第一位。Micro RNAs(mi RNAs)是內(nèi)源性非編碼小RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),參與了正常細(xì)胞的增殖,細(xì)胞分化,細(xì)胞代謝及細(xì)胞凋亡等生物生理進(jìn)程,也與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。根據(jù)調(diào)控靶基因不同,mi RNAs可作為抑癌基因或癌基因參與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥等病理進(jìn)程。目前mi RNAs與漿液性卵巢癌的研究也有報(bào)道,但作用機(jī)理尚不十分明確。目前國(guó)外研究人員認(rèn)為,漿液性卵巢癌主要起源于輸卵管上皮,且以傘端多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)組前期以正常輸卵管傘端組織為對(duì)照,經(jīng)mi RNA芯片篩選,發(fā)現(xiàn)mi R-450a-5p在漿液性卵巢癌組織中表達(dá)量顯著下調(diào),且其功能機(jī)制尚未在卵巢癌中研究報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)組選取mi R-450a-5p為研究分子,以正常人輸卵管傘端為對(duì)照,通過(guò)初步科學(xué)研究,希望mi R-450a-5p能成為早期診斷、治療及預(yù)防漿液性卵巢癌的重要生物學(xué)分子。基于前期芯片結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)組擬:(1)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)大樣本中mi R-450a-5p的表達(dá)差異情況,并分析mi R-450a-5p各組表達(dá)水平和漿液性卵巢癌臨床病理特征之間的相關(guān)性;(2)通過(guò)轉(zhuǎn)染mi R-450a-5p mimics構(gòu)建過(guò)表達(dá)mi R-450a-5p的漿液性卵巢癌SKOV3細(xì)胞系,通過(guò)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)研究過(guò)表達(dá)的mi R-450a-5p對(duì)SKOV3細(xì)胞系腫瘤生物學(xué)行為的影響;(3)通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(dual-luciferase reporter gene assay)驗(yàn)證mi R-450a-5p的靶基因及調(diào)控漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的可能分子信號(hào)通路機(jī)制,為臨床治療卵巢癌提供新的理論依據(jù)。目的:1.檢測(cè)mi R-450a-5p在漿液性卵巢癌中的表達(dá)情況,并分析mi R-450a-5p的表達(dá)與漿液性卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系。2.研究mi R-450a-5p對(duì)人漿液性卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、周期、凋亡腫瘤生物學(xué)行為的影響。驗(yàn)證mi R-450a-5p的靶基因,探討其在漿液性卵巢癌中發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。方法:1.選取101例漿液性卵巢癌石蠟包埋組織及50例正常輸卵管傘端石蠟包埋組織。所有樣本的選取均由2位資深病理專家判讀完成。2.用q RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證芯片結(jié)果,并分析mi R-450a-5p表達(dá)水平和臨床病理特征分組之間相關(guān)性。3.用mi R-450a-5p mimics轉(zhuǎn)染人漿液性卵巢癌SKOV3細(xì)胞,構(gòu)建過(guò)表達(dá)mi R-450a-5p的細(xì)胞系,并設(shè)陰性對(duì)照組(NC)及空白對(duì)照組(Blank),通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡。4.使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)mi R-450a-5p可能調(diào)控的靶基因,查閱相關(guān)文獻(xiàn),選定靶基因。5.用western blot及dual-luciferase reporter gene assay驗(yàn)證mi R-450a-5p可能的靶基因。6.結(jié)果采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),P0.05差異認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.Mi R-450a-5p在漿液性卵巢癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常輸卵管傘端組織。2.Mi R-450a-5p的表達(dá)水平與漿液性卵巢癌臨床病理特征之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.MTT實(shí)驗(yàn):過(guò)表達(dá)mi R-450a-5p組細(xì)胞增殖活力與NC組、blank組無(wú)明顯差異,提示了mi R-450a-5p對(duì)SKOV3細(xì)胞系的增殖活力無(wú)明顯影響。Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)均顯示轉(zhuǎn)染mi R-450a-5p mimics后,細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯減弱,提示過(guò)表達(dá)的mi R-450a-5p不僅抑制了SKOV3細(xì)胞系的遷移能力,對(duì)其侵襲能力也有抑制。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):Mi R-450a-5p mimics組細(xì)胞遷移能力較NC組、blank組降低,提示過(guò)表達(dá)的mi R-450a-5p抑制了SKOV3細(xì)胞系的遷移能力。流式細(xì)胞術(shù):過(guò)表達(dá)mi R-450a-5p后,mimics組細(xì)胞周期明顯被阻滯于G1期;Mi R-450a-5p mimics組、N C組、blank組凋亡結(jié)果無(wú)明顯差異。4.通過(guò)生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)mi R-450a-5p靶基因并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),分析DUSP10可能為mi R-450a-5p的靶基因。5.通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mi R-450a-5p mimics組DUSP10蛋白表達(dá)水平顯著性降低;Dual-luciferase reporter gene assay實(shí)驗(yàn)提示mi R-450a-5p的靶基因?yàn)镈USP10。結(jié)論:1.以正常輸卵管傘端為對(duì)照,經(jīng)大樣本驗(yàn)證,mi R-450a-5p在漿液性卵巢癌中呈顯著性低表達(dá),提示mi R-450a-5p可能參與了漿液性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。2.過(guò)表達(dá)漿液性卵巢癌SKOV3細(xì)胞系mi R-450a-5p后,可降低SKOV3細(xì)胞侵襲及遷移能力,并將細(xì)胞周期阻滯于G1期。3.Mi R-450a-5p靶基因可能為DUSP10,通過(guò)mi R-450a-5p/DUSP10/MAPKs通路調(diào)節(jié)漿液性卵巢癌進(jìn)展。4.Mi R-450a-5p可能作為抑癌基因在漿液性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了作用,有望成為早期診斷及靶向治療漿液性卵巢癌的新的生物分子。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：1290407