本文關(guān)鍵詞：HNF1α，HNF4α，，F(xiàn)OXA3聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞重編程

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【摘要】：研究背景和目的肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第六位,病死率居第二位。盡管近年來肝癌的診療技術(shù)不斷發(fā)展,其早期診斷困難、放化療不敏感和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高的現(xiàn)狀沒有根本改觀。唯一被FDA批準(zhǔn)用于肝癌的靶向治療的藥物索拉非尼,治療效果非常不理想。因此,肝癌的治療研究亟需調(diào)整思路,尋找更加有效的治療手段。腫瘤的誘導(dǎo)分化是近些年興起的一種治療方法,分化治療可誘導(dǎo)低分化的腫瘤細(xì)胞向成熟表型分化,抑制其增殖和轉(zhuǎn)移并促進(jìn)其凋亡,從而達(dá)到治療腫瘤的目的。迄今分化治療應(yīng)用最好的是利用全反式維甲酸治療急性早幼粒白血病,已有大量的病人獲得了很好的治療效果。血液腫瘤分化治療的成功也帶動(dòng)了實(shí)體腫瘤的分化治療研究,相繼出現(xiàn)了應(yīng)用全反式維甲酸、二甲基亞砜和砷劑治療乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌的研究,但肝癌的分化治療研究目前還很少。肝細(xì)胞核因子(Hepatocyte nuclear factor,HNF)是一類在肝細(xì)胞中相對(duì)特異性高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,在肝細(xì)胞的分化和功能維持方面發(fā)揮重要作用。HNF家族包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)以及D-結(jié)合蛋白(DBP)6大類因子。已有研究顯示單獨(dú)應(yīng)用HNF1α或HNF4α導(dǎo)入HNF1α或HNF4α低表達(dá)的肝癌細(xì)胞后,可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化。但在相當(dāng)一部分肝癌中HNF1α或HNF4α的表達(dá)并不降低,對(duì)這部分肝癌而言,單獨(dú)應(yīng)用HNF1α或HNF4α療效有限。此外,將多種肝細(xì)胞核因子聯(lián)合導(dǎo)入肝癌細(xì)胞協(xié)同發(fā)揮作用,理論上誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化的效果可能更好。前期有學(xué)者從肝細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子中篩選能誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的轉(zhuǎn)錄因子,最終篩選到了HNF1α、HNF4α和FOXA3(HNF3γ)。將這三種因子聯(lián)合轉(zhuǎn)入人成纖維細(xì)胞后,可將人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成肝細(xì)胞(hi Heps,human induced hepatocytes)。hi Heps形態(tài)類似正常肝細(xì)胞,且具有肝細(xì)胞的標(biāo)志物和生物學(xué)功能。在前期研究的基礎(chǔ)上,本課題旨在聯(lián)合應(yīng)用HNF1α、HNF4α和FOXA3抑制肝癌惡性表型并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞向肝細(xì)胞重編程;希望藉此探索腫瘤細(xì)胞重編程的可能性及其可能機(jī)理,為癌癥的治療提供新的思路與方向。研究方法:1.通過realtime-RCR檢測(cè)不同肝癌細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞中HNF1α、HNF4α和FOXA3的表達(dá)情況。2.通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝癌組織芯片中HNF1α、HNF4α和FOXA3的表達(dá)情況。3.分別構(gòu)建表達(dá)HNF1α、HNF4α和FOXA3的三種腺病毒,并用realtime-PCR和蛋白印跡法(Western blot)驗(yàn)證表達(dá)三種因子的腺病毒感染肝癌細(xì)胞后的表達(dá)情況。4.將HNF1α、HNF4α和FOXA3腺病毒感染肝癌細(xì)胞后,通過realtime-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達(dá)水平。5.通過相差顯微鏡觀察三因子誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞的形態(tài)改變。6.利用基因芯片檢測(cè)并比較三因子誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞以及人原代肝細(xì)胞的基因表達(dá)差異。7.采用PAS、油紅染色、LDL攝取、尿素及白蛋白分泌等肝功能相關(guān)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)三因子誘導(dǎo)后的肝癌細(xì)胞肝功能的改善情況。8.通過流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)三因子對(duì)肝癌干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。9.通過CCK8、克隆形成、transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三因子誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性改善情況。10.建立PDX(patient-derived xenograft)模型并通過瘤內(nèi)注射三因子腺病毒,研究其體內(nèi)治療肝癌的效果。研究結(jié)果:1.不同肝癌細(xì)胞系中HNF1α、HNF4α和FOXA3三種肝細(xì)胞核因子的表達(dá)水平有較大差異。2.肝癌樣本中的三因子表達(dá)存在異質(zhì)性,且大多數(shù)癌中三因子表達(dá)均低于癌旁。3.聯(lián)合應(yīng)用HNF1α、HNF4α和FOXA3三種肝細(xì)胞核因子能上調(diào)肝癌細(xì)胞中大量肝功能相關(guān)基因表達(dá),且三因子聯(lián)合應(yīng)用的效果顯著優(yōu)于HNF1α、HNF4α、FOXA3單因子及兩兩組合(1+4、1+F、4+F)的效果。4.經(jīng)三因子誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞的形態(tài)較對(duì)照細(xì)胞更加扁平寬大,接近肝細(xì)胞的形態(tài)。5.基因芯片分析顯示三因子誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞差異很大,其可以和人原代肝細(xì)胞聚類。6.三因子誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞的肝細(xì)胞相關(guān)功能,如糖原合成、脂質(zhì)堆積、白蛋白攝入等較對(duì)照細(xì)胞得到很大改善。7.三因子聯(lián)合應(yīng)用能顯著下調(diào)肝癌細(xì)胞中肝癌干細(xì)胞的比例并抑制其自我更新能力。8.經(jīng)三因子誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞的惡性表型幾近消失。9.PDX中注射三因子腺病毒可有效抑制肝癌生長(zhǎng)并能增強(qiáng)其ALB表達(dá)并降低AFP表達(dá)。結(jié)論:HNF1α、HNF4α和FOXA3三種肝細(xì)胞核因子的在不同肝癌細(xì)胞中表達(dá)量差異較大,且大多數(shù)肝癌中三種因子表達(dá)均低;單一及兩兩組合的誘導(dǎo)效果遠(yuǎn)不及三種因子聯(lián)合應(yīng)用;經(jīng)過三因子誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞不僅其惡性生物學(xué)特性得到抑制,還表現(xiàn)出較好的肝細(xì)胞形態(tài)和功能,提示三因子聯(lián)合應(yīng)用可能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞向肝細(xì)胞重編程。本研究拓展了腫瘤細(xì)胞重編程的認(rèn)識(shí),也為肝癌的治療提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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