本文關(guān)鍵詞：Cu-PMPP-SAL誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡及其對TNFα激活的NF-κB通路的影響

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【摘要】：金屬配合物已經(jīng)被認為是抗癌藥物的潛在重要來源。一些基于鉑的抗腫瘤藥物,如順鉑,卡鉑和奧沙利鉑已被廣泛使用于臨床治療。然而,由于這些藥物有著嚴重的副作用和耐藥性。因此,迫切需要開發(fā)高效性且低毒的抗癌藥物。4-酰基吡唑啉酮類配合物,尤其是席夫基的衍生物,由于其具有多個活性配位點以及烯醇和酮結(jié)構(gòu)的互變異構(gòu)效應(yīng),而使得配位形成的新型絡(luò)合物具有不同的結(jié)構(gòu)。吡唑啉酮類金屬絡(luò)合物具有穩(wěn)定性高,易于合成,易于修飾,有非常豐富的抗菌,抗病毒和抗癌等生物活性優(yōu)勢。核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factorκB,NF-κB)是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其信號通路的失調(diào)與炎癥性疾病和一些癌癥相關(guān)。在乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素癌等癌癥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了NF-κB信號通路的激活,因此可通過藥物阻斷NF-κB信號通路來治療腫瘤。腫瘤壞死因子α(TNFα)是腫瘤細胞凋亡的誘導(dǎo)因子,但有研究發(fā)現(xiàn),TNFα也能激活NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,進而使得癌細胞對化療藥物引起的細胞毒作用耐受。而吡唑啉酮類化合物是否對HeLa細胞內(nèi)NF-κB信號通路產(chǎn)生影響尚未見報道。本研究在對25種吡唑啉酮衍生物進行抗腫瘤活性篩選的基礎(chǔ)上,研究較高抗腫瘤活性的化合物Cu-PMPP-SAL體內(nèi)外抑制癌細胞增殖,誘導(dǎo)癌細胞凋亡以及對腫瘤壞死因子α(TNFα)激活的NF-κB信號通路的影響,初步探討Cu-PMPP-SAL抗腫瘤作用機制及藥物毒性,可為新型吡唑啉酮金屬配合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化及抗腫瘤藥物研制與開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。本文的研究結(jié)果主要包括以下內(nèi)容:(1)通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)吡唑啉酮衍生物作用HeLa細胞72 h后,化合物Cu-PMPP-SAL、Cu-PMPP-TAH、Cu-PMBP-TAH、Cu-PMPP-nSAL都具有很好的抗腫瘤活性,IC50值分別為:2.082μg/mL、1.287μg/mL、1.186μg/mL、2.559μg/mL,并發(fā)現(xiàn)Cu-PMPP-SAL對HeLa和Eca-109細胞生長抑制作用良好,值得進一步研究其作用機制。(2)cu-pmpp-sal對hela細胞具有生長抑制作用并通過caspase依賴的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。cu-pmpp-sal處理hela細胞后,通過hoechst33258染色法及透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)產(chǎn)生了凋亡小體,核物質(zhì)致密呈斑塊狀,邊集于核膜;ldh活性檢測顯示細胞的ldh釋放率上升,推測細胞膜可能出現(xiàn)了損傷;碘化丙錠(propidiumiodide,pi)單染色檢測結(jié)果表明hela細胞周期停滯在在s期;annexinv-fitc/pi雙染流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)hela細胞產(chǎn)生了顯著的凋亡變化(p0.05);cu-pmpp-sal顯著降低細胞內(nèi)線粒體膜電位水平(p0.05),并且能夠激活caspase-3和-9的活性。此外,westernblot法研究發(fā)現(xiàn)化合物能夠誘導(dǎo)hela細胞質(zhì)內(nèi)細胞色素c(cyto-c)含量上升,parp蛋白裂解,上調(diào)bax蛋白水平,下調(diào)bcl-2蛋白水平。提示cu-pmpp-sal可能通過caspase依賴的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。(3)cu-pmpp-sal可能通過抑制iκ-bα的磷酸化進而抑制nf-κb信號通路的激活。通過mtt法檢測發(fā)現(xiàn)cu-pmpp-sal對tnf-α刺激后的hela細胞的生長具有抑制作用;nf-κb雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明,cu-pmpp-sal抑制了nf-κb的表達;westernblot檢測結(jié)果證實了cu-pmpp-sal能夠抑制hela細胞nf-κb信號通路上游的iκbα的磷酸化。由此說明cu-pmpp-sal可能通過抑制iκ-bα的磷酸化進而抑制nf-κb信號通路的激活,從而導(dǎo)致細胞死亡。(4)cu-pmpp-sal體內(nèi)外抑制b16細胞的生長,并能通過抑制血管生成的方式抑制體內(nèi)腫瘤組織的生長。通過mtt法檢測發(fā)現(xiàn)cu-pmpp-sal能夠抑制b16細胞增殖,其ic50值為4.021μg/ml,hoechst33258染色法顯示細胞內(nèi)有凋亡小體,pi單染和annexinv-fitc/pi雙染流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明細胞周期阻滯在g0/g1期,細胞凋亡率與對照組相比顯著增加(p0.05)。檢測化合物對b16荷瘤c57小鼠的作用結(jié)果顯示,cu-pmpp-sal治療組小鼠b16實體瘤生長速度較慢,腫瘤體積小于對照組(p0.05)。高、中、低濃度(30mg/kg、20mg/kg、10mg/kg)劑量治療組的抑瘤率分別為54.8%、44.44%和35.58%。顯微鏡下可見中濃度、高濃度劑量組的腫瘤細胞有不同程度的點、片狀的壞死,而肝、肺等組織并無明顯的病理損傷。免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)中濃度、高濃度劑量組中瘤體細胞中高度糖基化的I型跨膜糖蛋白(CD34)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的陽性表達指數(shù)都低于對照組(P0.01)。說明Cu-PMPP-SAL能在體內(nèi)外以時間及劑量依賴性的方式抑制B16細胞的生長,并能通過抑制血管生成的方式抑制體內(nèi)腫瘤組織的生長。(5)Cu-PMPP-SAL對小鼠毒性較小,具有較好的安全性。小鼠急性毒性試驗顯示,Cu-PMPP-SAL經(jīng)腹腔注射LD50為:33 mg/kg,95%的可信限為:25.5-43mg/kg;高劑量組(200 mg/kg、400 mg/kg、800 mg/kg)使中毒小鼠均出現(xiàn)不同程度的呼吸心跳加快、抽搐等癥狀。小鼠死亡率隨Cu-PMPP-SAL劑量的增加而增加,較陽性藥物順鉑DDP劑量組(12.5 mg/kg)具有較好的安全性。綜上所述,Cu-PMPP-SAL能通過caspase依賴的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡,并且還能通過抑制HeLa細胞內(nèi)Iκ-Bα的磷酸化進而抑制NF-κB的活性。Cu-PMPP-SAL在體內(nèi)外還能抑制B16細胞生長,可能通過抑制血管生成而有效地抑制B16實體瘤的生長。該化合物對小鼠急性毒性較小,具有較好的安全性。
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R73-36

【參考文獻】

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1 李志偉 ,魯廣恩 ,胡安國 ,楊五計 ,戴勇;VEGF表達及MVD與肝細胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2003年16期

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本文編號：1281911