本文關(guān)鍵詞：TPO過表達(dá)介導(dǎo)的異常骨髓微環(huán)境在白血病細(xì)胞干性維持中的作用

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【摘要】：目的：異常的骨髓微環(huán)境參與白血病的發(fā)生與發(fā)展,白血病發(fā)生過程中也會(huì)引起微環(huán)境的重塑。在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn),急性髓系白血病病人骨髓血漿中血小板生成素(TPO)的水平顯著高于正常人,提示骨髓中TPO水平的異常升高可能與急性髓系白血病相關(guān),且有文獻(xiàn)報(bào)道在白血病的微環(huán)境重塑過程中出現(xiàn)TPO的升高。為深入研究異常微環(huán)境在白血病細(xì)胞干性維持及白血病發(fā)生發(fā)展中的作用,我們將TPO轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,體外實(shí)驗(yàn)探索其在白血病細(xì)胞干性中的作用,進(jìn)一步運(yùn)用組織工程學(xué)的方法在免疫缺陷小鼠體內(nèi)重建異位人的骨髓微環(huán)境,并用這種體內(nèi)模型研究過表達(dá)TPO的異常的骨髓微環(huán)境在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：構(gòu)建pCDH-EF1-TPO-T2A-copGFP慢病毒載體,感染人血小板裂解液(HPL)培養(yǎng)的第二代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后,流式細(xì)胞術(shù)分選GFP陽性過表達(dá)TPO的間充質(zhì)干細(xì)胞以及作為對(duì)照感染了空載體的間充質(zhì)干細(xì)胞,WB鑒定兩組間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)TPO的蛋白表達(dá),免疫熒光共聚焦檢測(cè)轉(zhuǎn)入的TPO在細(xì)胞內(nèi)定位情況,ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中TPO的分泌水平。將急性髓系白血病細(xì)胞系TF-1分別與這兩組間充質(zhì)干細(xì)胞體外共培養(yǎng)4天后,KI67及7-AAD標(biāo)記、流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組TF-1細(xì)胞的GO期細(xì)胞比例的差異；Annexin V及PI標(biāo)記、流式細(xì)胞儀檢測(cè)VP16對(duì)兩組TF-1細(xì)胞處理24h和48h后的細(xì)胞凋亡情況；MTT法檢測(cè)兩組TF-1細(xì)胞增殖能力,PI標(biāo)記、流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組TF-1細(xì)胞的細(xì)胞周期。在免疫缺陷小鼠體內(nèi)重建異位的人骨髓微環(huán)境實(shí)驗(yàn)中,通過反復(fù)凍融濃縮后血小板獲得人血小板裂解液(HPL),以α-MEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別添加10% HPL和10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。比較兩種添加成分對(duì)MSC形態(tài)、免疫表型、多向分化能力以及增殖能力的影響；將HPL培養(yǎng)的MSC接種于β-TCP支架材料并移植到免疫缺陷小鼠背部皮下,8-12W后取出移植體做HE染色,觀察MSC在體內(nèi)形成骨以及骨髓結(jié)構(gòu)的能力。將過表達(dá)TPO間充質(zhì)干細(xì)胞以及作為對(duì)照感染了空載體的間充質(zhì)干細(xì)胞分別接種于β-TCP支架材料并移植到免疫缺陷小鼠背部皮下,8-12W后取出移植體做HE染色,觀察MSC在體內(nèi)形成異常骨髓微環(huán)境的情況。結(jié)果：成功構(gòu)建pCDH-EF1-TPO-T2A-copGFP慢病毒載體,包裝病毒,感染間充質(zhì)干細(xì)胞。WB檢測(cè)到過表達(dá)TPO的間充質(zhì)干細(xì)胞胞內(nèi)有TPO的表達(dá),空載體組也有微弱的內(nèi)源性的表達(dá),免疫熒光共聚焦檢測(cè)TPO大部分定位在細(xì)胞漿內(nèi),ELISA檢測(cè)過表達(dá)TPO的間充質(zhì)干細(xì)胞TPO的分泌水平顯著高于空載體組。與過表達(dá)TPO的間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的TF-1細(xì)胞的GO期顯著高于對(duì)照組；用VP16處理TF-1細(xì)胞時(shí),與過表達(dá)TPO的間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的TF-1細(xì)胞在24h和48h細(xì)胞凋亡比例均顯著低于對(duì)照組,表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗化療殺傷；TPO水平的升高對(duì)TF-1細(xì)胞的增殖能力無明顯影響；與表達(dá)TPO的間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的TF-1細(xì)胞的G0/G1期比例高于對(duì)照組,S期比例低于對(duì)照組。在免疫缺陷小鼠體內(nèi)重建異位人骨髓微環(huán)境實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用HPL和FBS培養(yǎng)的MSC均呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形成纖維樣細(xì)胞結(jié)構(gòu),均具有多向分化能力；兩種體系培養(yǎng)的MSC免疫表型無明顯區(qū)別,但用人血小板裂解液培養(yǎng)的MSC具有更強(qiáng)的增殖能力和向成骨分化能力；用人血小板裂解液培養(yǎng)的MSC具有在體內(nèi)形成骨組織樣結(jié)構(gòu)的能力,成功構(gòu)建小鼠體內(nèi)的人的小骨模型。結(jié)論：間充質(zhì)干細(xì)胞TPO表達(dá)水平的升高可增加白血病細(xì)胞GO期比例,維持其靜息從而使其更能抵抗化療藥物的殺傷。HPL培養(yǎng)的MSC具有更強(qiáng)的增殖能力以及成骨分化潛能,它能在NOD/SCID鼠上重建異位的人源骨髓微環(huán)境。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.7

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