本文關鍵詞：FBXO8通過泛素化GSTP1參與結直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制

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【摘要】：研究目的與背景在全球范圍惡性腫瘤發(fā)病率中,結直腸癌發(fā)病率位居第三,僅次于肺癌與乳腺癌。且在結直腸癌確診時,部分病人已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,從而錯失了手術的黃金時期。而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的病人普遍生存率低且預后不良。結直腸癌的發(fā)病給病人家庭及社會造成沉重的負擔,因此研究結直腸癌發(fā)生發(fā)展及其轉(zhuǎn)移的相關分子機制,對結直腸癌轉(zhuǎn)移進行早期診斷與治療,對降低病人痛苦、提高生存率具有重要的意義。泛素酶體系統(tǒng)由E1(泛素激活酶)、E2(泛素結合酶)、E3(泛素連接酶)組成,共同參與蛋白的泛素化修飾從而被水解或失活。F-box家族屬于泛素蛋白酶體系統(tǒng)E3(泛素連接酶)的成員,其主要參與蛋白的泛素化降解從而調(diào)控細胞的增殖、凋亡、代謝、運動及損傷修復等,參與幾乎機體的一切生命活動,調(diào)控機體的穩(wěn)態(tài)。F-box家族主要由三類F-box蛋白組成：Fbls?Fbws/Fbxs,其中Fbls蛋白組成成員有12個,為F-box家族最大的組成成員,其新成員包括FBL73、FBL7。FBX08(F-box protein 8,又名FBX8)為Fbxs家族的一個新成員,目前關于FBX08在腫瘤中的報道較少,FBX08為新的C-myc結合蛋白,C-myc通過抑制FBX08而促進細胞的侵襲[4]。乳腺癌中FBX08的異常表達引起其參與Arf6的泛素化異常而促進乳腺癌細胞的侵襲。本課題組前期研究表明FBX08在肝癌組織中低表達且抑制肝癌細胞的增殖與侵襲能力,可能成為臨床治療肝細胞癌的有效靶點。由此可見,FBX08與腫瘤發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移關系密切。本課題選取FBX08泛素化作用為切入點,通過篩選FBX08的下游的泛素化靶蛋白探討其相關的結直腸癌發(fā)生發(fā)展機制。主要內(nèi)容如下：1,篩選FBX08的下游泛素化靶蛋白；2,探討FBX08與GSTP1的相互作用關系,證實FBX08對GSTP1的泛素化作用；3,探討GSTP1在FBX08誘導結直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用；4,明確GSTP1在結直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的表達及對結直腸癌細胞生物學行為的影響。本課題目的為探討FBX08在結直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的機制研究,為臨床結直腸癌的治療提供靶點。研究方法1、FBX08下游泛素化靶蛋白的篩選(1)構建FBX08過表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染進人胚胎腎細胞株293T之后qRT-PCR與Western-Blot實驗驗證其轉(zhuǎn)染效率。(2)IP(Immunoprecipitation)實驗分離出FBX08的結合蛋白后,運用質(zhì)譜分析技術將結合蛋白進行肽段分析,得出可能的FBX08下游泛素化靶蛋白。2、探討FBXO8與GSTP1的相互作用關系,證實FBX08對GSTP1的泛素化作用(1)運用co-IP(co-Immunoprecipitation)與免疫熒光共聚焦實驗,檢測FBX08與GSTP1的結合情況。(2)用蛋白酶體抑制劑MG132處理結直腸癌細胞SW620和SW620/FBXO8, Western-Blot檢測GSTP1的蛋白含量改變。(3)過表達或干擾FBX08后檢測下游GSTP1蛋白含量的改變。(4)將結直腸癌細胞轉(zhuǎn)染過表達ubquitin的載體,檢測FBX08的表達對GSTP1泛素化水平的影響。(5)構建GSTP1截短子。3、探討GSTP1在FBX08誘導結直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用(1)構建FBX08與GSTP1共同過表達與共干擾細胞株,qRT-PCR與Western-Blot實驗驗證其過表達與干擾效率。(2)MTT實驗、transwell侵襲實驗及裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移實驗檢測GSTP1在FBXO8誘導結直腸癌增殖侵襲轉(zhuǎn)移中的恢復作用。4、明確GSTP1在結直腸癌組織中的表達及對結直腸癌細胞生物學行為的影響(1)qRT-PCR檢測20例新鮮結直腸癌組織及其配對正常組織中GSTP1在mRNA水平上的表達。(2)免疫組化檢測GSTP1在136例結直腸癌組織及正常組織的表達,并分析GSTP1表達在正常組織與腫瘤組織中的表達差異和對結直腸癌分化、遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結轉(zhuǎn)移、預后的影響。(3)qRT-PCR與Western-Blot檢測6株結直腸癌細胞株中GSTP1的內(nèi)源性表達,選取高表達細胞株轉(zhuǎn)染siRNA進行干擾,選取低表達細胞株轉(zhuǎn)染慢病毒上清使GSTP1過表達,Western-Blot與qRT-PCR驗證其干擾與過表達效率。(4)運用MTT實驗、transwell侵襲實驗、裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移實驗檢測過表達或干擾GSTP1在體內(nèi)外對結直腸細胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。運用細胞流式檢測過表達或干擾GSTP1對結直腸癌細胞株凋亡的影響。實驗結果：1、FBXO8泛素化靶蛋白篩選構建pEGFP-C1/FBXO8過表達質(zhì)粒,其插入片段大小為960bp,測序結果及瓊脂糖凝膠電泳顯示質(zhì)粒構建成功。將構建的FBX08過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進293T細胞,效率驗證結果經(jīng)獨立樣本t檢驗,顯示FBX08在293T細胞中過表達2736倍(t=665.8,P0.001)。IP實驗與質(zhì)譜分析結果初步得出三個分子：NFX1、GGT7、GSTP1。因GSTP1的肽段比對得分高且重復性好,因此將其選為FBX08結合蛋白進行研究。2、FBX08泛素化降解GSTP12.1 FBX08與GSTP1的結合情況(1)將結直腸癌細胞株HCT116的兩種蛋白FBX08與GSTP1分別用兩種熒光抗體標記：FBX08(綠色)和GSTP1(紅色),con-focal結果顯示,FBX08胞漿表達,GSTP1在胞漿胞核均有表達,FBX08與GSTP1在胞漿存在共定位。(2)人胚胎腎細胞株293T中co-IP實驗結果顯示：FBX08能夠拉下GSTP1,GSTP1能夠拉下FBXO8,說明FBX08與GSTP1存在相互作用。2.2 FBXO8表達對GSTP1蛋白的影響(1)結直腸癌細胞株SW480轉(zhuǎn)染FBXO8過表達質(zhì)粒后,Western-Blot結果顯示GSTP1的蛋白含量降低。(2)結直腸癌細胞株SW620轉(zhuǎn)染干擾FBXO8表達的siRNA后,Western-Blot結果顯示GSTP1的表達量升高。2.3蛋白酶體抑制劑MG132對GSTP1表達的影響在裸細胞SW620與FBX08過表達細胞株SW620/FBXO8中,Western-Blot結果顯示MG132處理的細胞中GSTP1的表達量均較高,說明FBXO8降解GSTP1依賴泛素蛋白酶體途徑。2.4 GSTP1截短子的構建測序結果顯示GSTPl的三個截短子GSTP1-C端(252-630a)、GSTP1-N端(9-228a)、GSTP1-PTZ (22-588a)構建成功。(截短子的co-IP實驗正在進行中)3、GSTPl逆轉(zhuǎn)FBX08在結直腸癌增殖侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用(1)成功構建SW480/FBXO8/GSTP1共表達細胞,體外實驗結果經(jīng)析因方差分析,過表達GSTP1能夠恢復FBX08過表達對SW480細胞增殖的抑制作用(FTime=453.149,PTimer0.001;FCells=197.89, P Cells0.001;FTime×Cells= 26.039,PTime×Cells0.001);經(jīng)one-way ANOVO分析,過表達GSTP1能夠恢復FBX08過表達對SW480細胞侵襲的抑制作用(F=68.235,P0.001)；體內(nèi)實驗顯示過表達GSTP1能夠恢復FBXO8過表達對SW480裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的抑制作用(F=5.477,P=0.016)。(2)成功構建SW620/siFBXO8/siGSTPl雙干擾細胞株,體外實驗結果經(jīng)析因方差分析,干擾GSTP1能夠逆轉(zhuǎn)干擾FBX08對SW620細胞增殖的促進作用(FTime=819.974,PTimer0.001; FCells=81.03,Pcells0.001; FTime×Cells= 10.296,PTime×Cells0.001);經(jīng)one-way ANOVO分析,干擾GSTP1能夠逆轉(zhuǎn)干擾FBX08對SW620細胞侵襲的促進作用(F=27.447,P0.001)。4、GSTP1在結直腸癌中的表達及其對增殖侵襲的影響4.1 GSTP1在結直腸癌組織中的表達(1)qRT-PCR檢測20對新鮮配對組織中結直腸癌組織與配對組織中GSTP1mRNA的含量。2-△△Ct值通過配對樣本t檢驗分析,結果顯示：GSTP1在腫瘤組織中的表達明顯高于周圍正常組織(t=2.477,P0.05)。(2)免疫組化結果顯示：在正常配對組織中GSTP1集中在胞核表達,在結直腸癌組織中GSTP1在胞漿和胞核中均有表達�？ǚ綑z驗顯示GSTP1在癌組織中的表達明顯高于周圍正常組織,(P0.001)。生存分析顯示高表達GSTP1的患者具有較低的生存率(P=0.007)。4.2 GSTP1對結直腸癌細胞體內(nèi)外生物學行為的影響(1)結直腸癌細胞株SW620、SW480、HCT116、RKO、lovo、HT29中,GSTP1在SW480、RKO、Lovo細胞株中表達較低,而在HCT116、SW620細胞株中表達較高。(2)對內(nèi)源性表達量低的細胞株SW480、RKO進行GST TP1過表達,獨立樣本t檢驗分析,其中SW480細胞中過表達401.9倍,(t=19.43,P=0.000),RKO細胞中GSTP1過表達53.32倍,(t=13.43,P=0.0002)。對內(nèi)源性表達量高的細胞株SW620、HCT116進行GSTP1的干擾,one-way ANOVO分析,其中SW620中S1、S2、S3的干擾效率分別為0.465,0.3603,0.769,(F=121.056,P0.001),HCT116中S1、S2、S3的干擾效率分別為0.2042,0.1749,0.9681,(F=300.961,P0.001),證明干擾片段S1、S2的干擾效率較強。(3)過表達GSTP1之后體外增殖實驗結果經(jīng)析因方差分析,過表達GSTP1顯著促進SW480、RKO的體外增殖能力(FTime=741.627,PTime0.001;FCells=186.139, Pcells0.001; FTime×Cells= 47.391,PTime×Cells0.001;FTime=283.834, PTime0.001;Fcells=117.041, PCells0.001; FTime×Cells= 13.922,PTime×Cells0.001);過表達GSTP1之后體外侵襲實驗結果經(jīng)獨立樣本t檢驗,過表達GSTP1顯著促進SW480、RKO的體外侵襲能力(t=10.17,P0.0001;t=-11.14,P0.0001)。(4)干擾GSTP1(選取干擾片段S1、S2)后體外增殖實驗結果經(jīng)析因方差分析,干擾GSTP1顯著抑制SW620、HCT116的體外增殖能力(FTime=806.115, PTime0.001;FCells=292.199,PCells0.001;FTimexCells= 44.787,PTime×Cells0.001;FTime=156.783, PTime0.001;Fcells=152.425,PCells0.001;FTime×Cells= 10.635,PTime×Cells0.001);干擾GSTP1之后體外侵襲實驗結果經(jīng)one-way ANOVO分析,干擾GSTP1顯著抑制SW620、HCT116的體外侵襲能力(F=72.831,P0.001；F=608.011,P0.001)。干擾GSTP1之后,細胞流式結果經(jīng)獨立樣本t檢驗分析,與SW620/NC相比,SW620/siGSTP1的凋亡明顯增加(t=4.456,P=0.0112),即GSTP1抑制結直腸癌細胞凋亡。(5)過表達GSTP1之后體內(nèi)實驗結果經(jīng)獨立樣本t檢驗分析,裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移實驗中GSTP1顯著增強lovo細胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力(t=-2.319,P=0.043)。結論1.GSTP1為FBXO8的一個新的泛素化底物蛋白,FBX08通過泛素化降解GSTP1抑制結直腸癌增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移;2.GSTP1在結直腸癌組織中表達上調(diào)且與患者的較差預后相關,GSTP1促進結直腸癌細胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移能力。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

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