本文關(guān)鍵詞：STIM1調(diào)控頭頸鱗癌細胞凋亡與增殖的體內(nèi)外研究

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【摘要】：目的:STIM1(stromal interaction molecule 1)最早是由Kenneth Stauderman及其研究團隊在2005年發(fā)現(xiàn)的一種參與鈣庫調(diào)控的鈣離子內(nèi)流(Store-operated Ca2+entry,SOCE)的基因[1,2]。隨著對STIM1的研究深入發(fā)現(xiàn)STIM1在多種癌癥中都有異常表達,并參與多種腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程[3-5],但其在頭頸鱗癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中的表達及作用機制尚不清楚。本研究旨在明確STIM1在頭頸鱗癌組織中的表達情況及臨床意義,探討STIM1表達與頭頸鱗癌細胞凋亡與增殖的關(guān)系,初步探索STIM1調(diào)控頭頸鱗癌細胞凋亡的相關(guān)途徑。方法:1.收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院頭頸鱗癌手術(shù)標本蠟塊組織切片及對應(yīng)的正常組織切片共56對作為實驗對象,應(yīng)用IHC的方法檢測兩組組織標本中STIM1的相對表達量。收集患者臨床資料,進行5年總生存率分析。同時收集8組頭頸鱗癌患者手術(shù)過程留取的癌組織及切緣旁的正常組織,應(yīng)用蛋白免疫沉淀方法分析STIM1在癌組織及正常組織中蛋白的表達水平。數(shù)據(jù)分析使用SPSS18.0統(tǒng)計獲取軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.篩選TSCCA及Hep2頭頸鱗癌細胞系進行體外實驗,采用lipofectamine3000介導(dǎo)STIM1-si RNA對兩個細胞系進行轉(zhuǎn)染處理,應(yīng)用流式細胞術(shù)及Hoechst33258染色方法檢測轉(zhuǎn)染si-STIM1前后兩組細胞凋亡率的差異;應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染si-STIM1前后細胞周期分布變化。應(yīng)用WB檢測細胞凋亡及周期相關(guān)蛋白表達量的變化。篩選Tb3.1低表達STIM1細胞系進行高表達體外實驗,應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細胞凋亡率的變化;應(yīng)用fluo4/AM鈣離子探針檢測敲低STIM1表達后細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流情況;通過WB檢測caspase12的表達初步探索STIM1調(diào)控頭頸鱗癌細胞凋亡的主要途徑。3.選取TSCCA細胞建立裸鼠皮下成瘤動物模型,分為對照組及si-STIM1處理組,成瘤后動態(tài)觀察腫瘤生長速度,取瘤測量兩組腫瘤質(zhì)量,制作組織切片應(yīng)用HE染色觀察腫瘤細胞核形態(tài);免疫組化檢測細胞凋亡相關(guān)基因caspase3、caspase12、Bcl-2、BAX及細胞周期相關(guān)基因P21、cyclin D1的表達情況,對體外實驗進行進一步驗證。結(jié)果:1.IHC結(jié)果顯示STIM1在頭頸鱗癌組織中的表達(6.286±0.259)高于癌旁組織(2.393±0.226),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。WB進一步證實了以上結(jié)果,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。STIM1表達與腫瘤大小及病理分級相關(guān)。STIM1高表達組5年OS為25.9%,低表達組5年OS為48.3%(P0.05)。2.篩選TSCCA及Hep2鱗癌細胞系中轉(zhuǎn)染STIM1-si RNA,敲低STIM1的表達;篩選Tb3.1低表達STIM1細胞系,轉(zhuǎn)染STIM1高表達質(zhì)粒。應(yīng)用FACS及Hoechst33258染色法檢測STIM1細胞凋亡率:結(jié)果顯示敲低STIM1表達后TSCCA及Hep2細胞凋亡率增高(P0.05),而Tb3.1細胞中STIM1高表達后細胞凋亡率下降(P0.05)。WB檢測凋亡相關(guān)蛋白,STIM1敲低后凋亡基因caspase3、caspase12、BAX表達上調(diào),Bcl-2表達下降;轉(zhuǎn)染高表達STIM1質(zhì)粒后結(jié)果則相反。敲低STIM1表達后細胞周期停滯在G0/G1期,WB結(jié)果驗證了以上現(xiàn)象。3.敲低STIM1表達后,應(yīng)用fluo-4鈣離子探針檢測細胞內(nèi)鈣離子信號,發(fā)現(xiàn)鈣離子內(nèi)流減少,SOCE下降,觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。4.TSCCA荷鼠成瘤實驗結(jié)果顯示,抑制STIM1表達后腫瘤生長速度和重量均明顯低于對照組(P0.05)。HE染色顯示STIM1敲低組核分裂象及不典型增生減少。IHC結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染STIM1-si RNA組細胞漿caspase3、caspase12、BAX、P21的表達均高于對照組,而Bcl2、cyclin D1表達則低于對照組。結(jié)論:1.STIM1在頭頸鱗癌組織中呈高表達狀態(tài),與腫瘤大小及病理分級相關(guān),并與預(yù)后呈負相關(guān),提示其在頭頸鱗癌中可能起到癌基因的作用;2.STIM1影響頭頸鱗癌細胞的凋亡及增值,并參與SOCE過程,其參與凋亡的途徑為ER stress途徑;3.體內(nèi)實驗與體外實驗結(jié)果相一致。STIM1可作為分析人頭頸鱗癌發(fā)展過程的新靶點,為頭頸鱗癌的診斷和治療提供新的可能性。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.91
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本文編號：1273334