本文關(guān)鍵詞：STIM1調(diào)控頭頸鱗癌細(xì)胞凋亡與增殖的體內(nèi)外研究

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【摘要】：目的:STIM1(stromal interaction molecule 1)最早是由Kenneth Stauderman及其研究團(tuán)隊(duì)在2005年發(fā)現(xiàn)的一種參與鈣庫調(diào)控的鈣離子內(nèi)流(Store-operated Ca2+entry,SOCE)的基因[1,2]。隨著對(duì)STIM1的研究深入發(fā)現(xiàn)STIM1在多種癌癥中都有異常表達(dá),并參與多種腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程[3-5],但其在頭頸鱗癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中的表達(dá)及作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在明確STIM1在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)情況及臨床意義,探討STIM1表達(dá)與頭頸鱗癌細(xì)胞凋亡與增殖的關(guān)系,初步探索STIM1調(diào)控頭頸鱗癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)途徑。方法:1.收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院頭頸鱗癌手術(shù)標(biāo)本蠟塊組織切片及對(duì)應(yīng)的正常組織切片共56對(duì)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,應(yīng)用IHC的方法檢測兩組組織標(biāo)本中STIM1的相對(duì)表達(dá)量。收集患者臨床資料,進(jìn)行5年總生存率分析。同時(shí)收集8組頭頸鱗癌患者手術(shù)過程留取的癌組織及切緣旁的正常組織,應(yīng)用蛋白免疫沉淀方法分析STIM1在癌組織及正常組織中蛋白的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)分析使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)獲取軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.篩選TSCCA及Hep2頭頸鱗癌細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),采用lipofectamine3000介導(dǎo)STIM1-si RNA對(duì)兩個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst33258染色方法檢測轉(zhuǎn)染si-STIM1前后兩組細(xì)胞凋亡率的差異;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染si-STIM1前后細(xì)胞周期分布變化。應(yīng)用WB檢測細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化。篩選Tb3.1低表達(dá)STIM1細(xì)胞系進(jìn)行高表達(dá)體外實(shí)驗(yàn),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡率的變化;應(yīng)用fluo4/AM鈣離子探針檢測敲低STIM1表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流情況;通過WB檢測caspase12的表達(dá)初步探索STIM1調(diào)控頭頸鱗癌細(xì)胞凋亡的主要途徑。3.選取TSCCA細(xì)胞建立裸鼠皮下成瘤動(dòng)物模型,分為對(duì)照組及si-STIM1處理組,成瘤后動(dòng)態(tài)觀察腫瘤生長速度,取瘤測量兩組腫瘤質(zhì)量,制作組織切片應(yīng)用HE染色觀察腫瘤細(xì)胞核形態(tài);免疫組化檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase3、caspase12、Bcl-2、BAX及細(xì)胞周期相關(guān)基因P21、cyclin D1的表達(dá)情況,對(duì)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果:1.IHC結(jié)果顯示STIM1在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)(6.286±0.259)高于癌旁組織(2.393±0.226),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。WB進(jìn)一步證實(shí)了以上結(jié)果,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。STIM1表達(dá)與腫瘤大小及病理分級(jí)相關(guān)。STIM1高表達(dá)組5年OS為25.9%,低表達(dá)組5年OS為48.3%(P0.05)。2.篩選TSCCA及Hep2鱗癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染STIM1-si RNA,敲低STIM1的表達(dá);篩選Tb3.1低表達(dá)STIM1細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染STIM1高表達(dá)質(zhì)粒。應(yīng)用FACS及Hoechst33258染色法檢測STIM1細(xì)胞凋亡率:結(jié)果顯示敲低STIM1表達(dá)后TSCCA及Hep2細(xì)胞凋亡率增高(P0.05),而Tb3.1細(xì)胞中STIM1高表達(dá)后細(xì)胞凋亡率下降(P0.05)。WB檢測凋亡相關(guān)蛋白,STIM1敲低后凋亡基因caspase3、caspase12、BAX表達(dá)上調(diào),Bcl-2表達(dá)下降;轉(zhuǎn)染高表達(dá)STIM1質(zhì)粒后結(jié)果則相反。敲低STIM1表達(dá)后細(xì)胞周期停滯在G0/G1期,WB結(jié)果驗(yàn)證了以上現(xiàn)象。3.敲低STIM1表達(dá)后,應(yīng)用fluo-4鈣離子探針檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào),發(fā)現(xiàn)鈣離子內(nèi)流減少,SOCE下降,觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。4.TSCCA荷鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抑制STIM1表達(dá)后腫瘤生長速度和重量均明顯低于對(duì)照組(P0.05)。HE染色顯示STIM1敲低組核分裂象及不典型增生減少。IHC結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染STIM1-si RNA組細(xì)胞漿caspase3、caspase12、BAX、P21的表達(dá)均高于對(duì)照組,而Bcl2、cyclin D1表達(dá)則低于對(duì)照組。結(jié)論:1.STIM1在頭頸鱗癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài),與腫瘤大小及病理分級(jí)相關(guān),并與預(yù)后呈負(fù)相關(guān),提示其在頭頸鱗癌中可能起到癌基因的作用;2.STIM1影響頭頸鱗癌細(xì)胞的凋亡及增值,并參與SOCE過程,其參與凋亡的途徑為ER stress途徑;3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。STIM1可作為分析人頭頸鱗癌發(fā)展過程的新靶點(diǎn),為頭頸鱗癌的診斷和治療提供新的可能性。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.91
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本文編號(hào)：1273334