本文關鍵詞：MicroRNA-27b，，microRNA-101和microRNA-128調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子-C抑制胃癌血管生成的研究

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【摘要】：背景：胃癌是一種常見的惡性腫瘤,盡管根治手術(shù)有一定效果,但是具有遠處轉(zhuǎn)移的患者預后卻非常差。轉(zhuǎn)移是胃癌患者癌細胞擴散的主要途徑之一。VEGF-C是血小板源生長因子家族成員之一,它不僅能夠與VEGFR-3結(jié)合引起淋巴管新生,而且也可以和VEGFR-2結(jié)合引起血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移。研究表明腫瘤細胞可以分泌VEGF-C,通過自分泌方式作用于癌細胞本身促進其遷移和浸潤能力。VEGF-C在腫瘤發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要作用。然而調(diào)控VEGF-C的機制目前尚不清楚。MiRNAs是近期腫瘤研究的前沿熱點之一。研究表明,miRNAs可通過直接作用于靶mRNA參與調(diào)控蛋白翻譯及mRNA穩(wěn)定性作用。本研究旨在探討調(diào)控VEGF-C表達的機制,并驗證靶向調(diào)控VEGF-C的miR-27b,miR-101和miR-128對胃癌細胞遷移,浸潤能力及血管內(nèi)皮細胞增殖,遷移和血管生成能力的影響。并且研究了3個miRNAs對胃癌患者預后的影響。方法：收集胃癌組織標本,完善病例臨床資料。免疫組織化學方法檢測103例胃癌標本中VEGF-C的表達及血管和淋巴管數(shù)量,分析VEGF-C與胃癌患者臨床病理參數(shù),血管和淋巴管數(shù)量的關系。雙熒光素酶報告基因檢測驗證靶向調(diào)控VEGF-C的miRNAs。Westerm-Blot檢測miR-27b, miRNA-101和miRNA-128過表達后靶基因VEGF-C表達的改變,驗證3個miRNAs的確可以調(diào)控VEGF-C的表達。瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-27b, miRNA-101和]miRNA-128至胃癌細胞系,Tanswell遷移與浸潤試驗檢測胃癌細胞系遷移與浸潤能力及血管內(nèi)皮細胞遷移能力的改變；EdU實驗檢測血管內(nèi)皮細胞的增殖能力變化；小管形成實驗檢測血管內(nèi)皮細胞的新生血管形成能力。提取103例胃癌組織、12例癌旁非腫瘤組織及3種胃癌細胞系中的RNA,逆轉(zhuǎn)錄并用實時熒光定量檢測miR-27b,miR-101和miR-128的表達。結(jié)果：臨床病理參數(shù)分析顯示VEGF-C的表達與腫瘤大小,TNM分級,臨床分期相關,VEGF-C的表達與血管密度和淋巴管密度呈正相關,并且miR-27b, miR-101, miR-128與VEGF-C的表達及血管密度都呈現(xiàn)負相關。通過1miRanda, TargetScan, miRWalk軟件預測并結(jié)合相關文獻初步選定5個能與VEGF-C 3'UTR結(jié)合的miRNAs,包括miR-27b, miR-101, miR-128, miR-144和miR-186,分別進行雙熒光素酶實驗檢測,證實miR-27b, miR-101和miR-128對VEGF-C有明顯的調(diào)控作用。Western Blotting實驗結(jié)果顯示：過表達miR-27b, miR-101和miR-128組與對照組相比, VEGF-C蛋白表達顯著降低,進一步驗證miR-27b,miR-101和miR-128確實可以靶向調(diào)控VEGF-C的表達。Tanswell遷移與浸潤試驗證實轉(zhuǎn)染miR-27b, miR-101, miR-128后,胃癌細胞MKN-45和SGC-7901的遷移與浸潤能力以及均受到明顯抑制。將這3個miRNAs分別轉(zhuǎn)染入胃癌細胞,取培養(yǎng)48小時之后的胃癌細胞上清懸液用來培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞,這種條件下培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞做Tanswell遷移,EdU及tube formation實驗,結(jié)果顯示血管內(nèi)皮的遷移能力,增殖能力及新生血管生成能力都受到明顯抑制。實時熒光定量PCR (RT-qPCR)定量檢測miR-27b, miR-101和miR-128的表達證實：miR-27b, miR-101和miR-128在胃癌各組樣本中均有表達；與癌旁非腫瘤組織相比,這3個miRNAs在胃癌組織和3種胃癌細胞系中表達明顯降低；但是3個miRNAs的表達量與臨床病例參數(shù)分析沒有意義。結(jié)論：我們證實miR-27b, miR-101, miR-128通過下調(diào)VEGF-C表達抑制胃癌細胞的遷移和浸潤能力以及血管內(nèi)皮細胞的增殖,遷移和小管形成能力。并且,3個miRNAs通過下調(diào)VEGF-C的表達抑制了胃癌組織血管生成從而起到抑制胃癌進展的作用。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

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本文編號：1272543