本文關(guān)鍵詞：胃癌發(fā)生中RBP2對(duì)BECN1的調(diào)控機(jī)制

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【摘要】：研究背景和目的：胃癌是一種常見的惡性腫瘤。組蛋白的修飾變化在癌癥發(fā)生發(fā)展中起著重要的表觀遺傳調(diào)控作用。研究已證明,RBP2 (RB Binding Protein 2)是一種組蛋白去甲基化酶,能夠?qū)M蛋白H3上第四位賴氨酸位點(diǎn)的三或二甲基化進(jìn)行去甲基化修飾,調(diào)控下游靶基因啟動(dòng)子活性,并參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。自噬是受到嚴(yán)格調(diào)控的降解長壽命蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器的分解代謝途徑,這個(gè)過程在癌癥發(fā)生發(fā)展中也可能起重要作用。自噬相關(guān)蛋白BECN1 (Beclin 1)是自噬的形成和成熟過程中必不可少的分子,在BECN1啟動(dòng)子區(qū)存在RBP2特異性結(jié)合的位點(diǎn)。因此研究組蛋白去甲基化酶RBP2在胃癌自噬過程中的作用以及對(duì)BECN1的調(diào)控機(jī)制很有必要。實(shí)驗(yàn)方法：1.人體組織水平在21對(duì)人胃癌及對(duì)應(yīng)的癌旁組織臨床標(biāo)本中通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)RBP2與BECN1在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)水平及相關(guān)性。2.細(xì)胞水平在胃黏膜上皮來源的胃癌細(xì)胞系(AGS, BGC-823, GES-1)中,分別轉(zhuǎn)染RBP2高表達(dá)質(zhì)�；蛘逺BP2特異性干擾RNA,通過QRT-PCR和Western blotting法檢測(cè)RNA水平和蛋白水平上高表達(dá)或抑制RBP2對(duì)細(xì)胞系中BECN1表達(dá)的影響。通過分子克隆構(gòu)建PGL-3-BECN1啟動(dòng)子區(qū)質(zhì)粒(BECN1啟動(dòng)子區(qū)含有RBP2特異性識(shí)別結(jié)合的CCGCCC序列),然后轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞系中,用雙熒光素酶檢測(cè)RBP2是否對(duì)BECN1的啟動(dòng)子活性有直接或間接的調(diào)控作用。在轉(zhuǎn)染RBP2高表達(dá)質(zhì)�；蛐「蓴_RNA的胃癌細(xì)胞BGC-823中,通過免疫熒光檢測(cè)自噬作用強(qiáng)度的變化。3.動(dòng)物模型用慢病毒包裝RBP2小干擾RNA,轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞BGC-823中進(jìn)行濃度梯度篩選,在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度,確定最合適的轉(zhuǎn)染濃度。之后將熒光較強(qiáng)的細(xì)胞用胰酶消化下來到細(xì)胞瓶當(dāng)中擴(kuò)大培養(yǎng),用嘌呤霉素篩選,獲得具有RBP2穩(wěn)定干擾效率的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。將穩(wěn)定表達(dá)RBP2 siRNA的胃癌細(xì)胞通過皮下注射到裸鼠體內(nèi),并以穩(wěn)定表達(dá)Control shRNA的細(xì)胞株作為陰性對(duì)照。在腫瘤長出后開始測(cè)量腫瘤體積,繪制腫瘤生長曲線。之后通過QRT-PCR和免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)RBP2和BECN1的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.RBP2和BECN1在人胃癌組織標(biāo)本中的表達(dá)水平高于癌旁組織中的表達(dá)水平,存在顯著性差異,并與RBP2的表達(dá)呈正相關(guān)。同時(shí),RBP2和BECN1的表達(dá)與患者的年齡,性別,腫瘤大小,分化程度無關(guān)。2.在胃癌細(xì)胞系(AGS,BGC-823,GES-1)中,抑制RBP2的表達(dá)會(huì)使BECN1的RNA和蛋白表達(dá)水平下降。相應(yīng)地,上調(diào)RBP2的表達(dá)會(huì)使BECN1的表達(dá)水平增加。3.在胃癌細(xì)胞系中,RBP2可以通過結(jié)合到BECN1的啟動(dòng)子區(qū)(CCGCCC位點(diǎn))直接調(diào)控BECN1的基因表達(dá)。4.在胃癌細(xì)胞系中,抑制或增強(qiáng)RBP2的表達(dá)水平會(huì)相應(yīng)的影響胃癌細(xì)胞中的自噬作用強(qiáng)度。5.在裸鼠皮下成瘤模型中,穩(wěn)定表達(dá)RBP2 shRNA的胃癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組成瘤能力受到顯著抑制,同時(shí)BECN1的表達(dá)水平下降,自噬作用降低。結(jié)論：RBP2通過影響B(tài)ECN1的啟動(dòng)子區(qū)活性直接調(diào)控BECN1的表達(dá),從而參與胃癌細(xì)胞的自噬過程。這可能是胃癌發(fā)生中一種新的與組蛋白修飾改變相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制,同時(shí)也可能提供一種潛在的胃癌治療方法。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2

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1 宋平;胃癌發(fā)生中RBP2對(duì)BECN1的調(diào)控機(jī)制[D];山東大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1265568