本文關(guān)鍵詞：miR-18b增強(qiáng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞對順鉑化療敏感性的作用及其機(jī)制

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【摘要】：乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤之一，三陰性乳腺癌（Triple negativebreast cancer, TNBC）的重要特點就是缺乏孕酮受體（progesterone receptor）、雌激素受體（estrogen receptor）和人類表皮生長因子受體（human epidermalgrowthfactor receptor-2, HER2），而針對它們的內(nèi)分泌治療及靶向治療無效，因此相對其他類型乳腺癌其預(yù)后差，生存期短。目前臨床治療上仍以化療為主,多個研究表明，順鉑對三陰性乳腺癌化療有效，提高三陰性乳腺癌對順鉑的化療敏感性，能有效改善該類患者的預(yù)后。 微小RNA（microRNA，miRNA）是一段長度約為20~22bpd大小的、基因遺傳學(xué)高度保守的非編碼RNA，具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，已逐漸引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。它能通過與靶基因3’端非翻譯序列（untranslate region, UTR）的特異性結(jié)合來調(diào)控靶基因的降解或者表達(dá)，并在轉(zhuǎn)錄后水平基礎(chǔ)上調(diào)控靶基因的功能。大量研究已證實miRNA的生物學(xué)功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的。同時研究還發(fā)現(xiàn)miRNA不僅在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，而且還參與腫瘤放化療敏感性的調(diào)控。而最新研究表明miR-18b在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)水平升高，并調(diào)節(jié)乳腺癌侵襲的相關(guān)基因，但miR-18b在乳腺癌的化療過程中的生物學(xué)作用及其機(jī)制仍不清楚。 程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death, PCD）與胚胎發(fā)育（morphogenesis）、機(jī)體穩(wěn)態(tài)（homeostasis）和排除具有癌變傾向的細(xì)胞等生理活動密切相關(guān)。凋亡并不是生物體內(nèi)唯一的程序性細(xì)胞死亡方式，自噬是獨立于凋亡之外的另一種程序性細(xì)胞死亡方式，幾年的研究顯示當(dāng)細(xì)胞處在缺氧狀態(tài)下，細(xì)胞常自行吞噬長壽命蛋白和受損細(xì)胞器來獲取生存的物質(zhì)和能量，從而利于細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下存活。miRNA通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）、衰老（senescence）和細(xì)胞周期阻滯（cell cycle arrest）等機(jī)制，發(fā)揮著促進(jìn)癌癥或者抑制癌癥的雙刃劍作用。miRNA通過以上機(jī)制來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。miRNAs在乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌和肝癌等惡性腫瘤中有差異性表達(dá)，其生物學(xué)功能常被認(rèn)為是“癌基因（oncogene）”和“抑癌基因（tumor suppressors）”，是一種重要的生物標(biāo)志物。因此檢測體內(nèi)miRNA變化可對體內(nèi)惡性腫瘤進(jìn)行早期診斷、預(yù)后判斷；干預(yù)miRNA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及自噬等程序性細(xì)胞死亡，成為治療惡性腫瘤的一種手段。 miR-18b在多種乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)水平顯著升高，多種研究表明，它是參與調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因，然而，miR-18b在乳腺癌的化療過程中發(fā)揮什么生物學(xué)作用和機(jī)制仍缺乏實驗研究，它的眾多生物學(xué)功能還需要繼續(xù)研究探索。本實驗研究旨在闡明miR-18b如何調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的化療敏感性及其可能的作用機(jī)制。 目的 探討miR-18b在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞對順鉑化療敏感性中的作用及其可能的機(jī)制。 方法 采用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-18b的靶基因；用基因工程方法構(gòu)建雙熒光素酶表達(dá)載體；培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株細(xì)胞MDA-MB-231，凍存對數(shù)生長期的細(xì)胞。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人工合成的mimic，轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染條件分為MDA-MB-231組、 MDA-MB-231+DDP組、 MDA-MB-231-NC組、MDA-MB-231-NC+DDP組、MDA-MB-231mimic組和MDA-MB-231mimic+DDP組，以Negative control（NC）作為對照，根據(jù)試劑盒逐步提取各組MDA-MB-231細(xì)胞中的miR-18b，應(yīng)用（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）法檢測細(xì)胞組的miR-18b的表達(dá)水平變化；Western blot檢測轉(zhuǎn)染后ATM蛋白水平變化。用細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK8)檢測細(xì)胞的化療敏感性。 結(jié)果 1. miR-18b靶基因的預(yù)測 通過miRNA預(yù)測靶基因的生物信息學(xué)工具(PicTar、miRBase和Taregestscan）初步預(yù)測miR-18b的靶基因，即ATM可能為miR-18b靶基因。 2. miR-18b在不同分組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)情況 與NC組相比，MDA-MB-231轉(zhuǎn)染mimic組miR-18b表達(dá)升高20倍以上。mimic+DDP組與NC組相比，miR-18b表達(dá)水平升高60倍以上，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p0.001）。 3.驗證ATM為miR-18b靶基因 1）.MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)miR-18b抑制ATM3’UTR載體熒光素酶活性 過表達(dá)miR-18b后pMIR-ATM熒光素酶活性的相對值降到70%，說明miR-18b明顯抑制了pMIR-ATM熒光素酶的活性。由此初步驗證，ATM為miR-18b靶基因，并與ATM3’UTR序列的部分結(jié)合從而發(fā)揮調(diào)控作用。 2）.過表達(dá)miR-18b抑制MDA-MB-231細(xì)胞中ATM蛋白的表達(dá) 通過轉(zhuǎn)染mimic在MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)miR-18b，與MDA-MB-231-NC組比較，MDA-MB-231mimic組細(xì)胞中的ATM蛋白水平明顯降低（p0.05）;與MDA-MB-231-NC+DDP組比較，MDA-MB-231mimic+DDP組細(xì)胞中的ATM蛋白水平也明顯降低（p0.05），，由此證實過表達(dá)miR-18b抑制MDA-MB-231細(xì)胞中ATM蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步確定miR-18b是ATM的靶基因。 4.過表達(dá)miR-18b對MDA-MB-231細(xì)胞化療敏感性的影響 與MDA-MB-231NC組比較，在不同濃度的DDP作用后，轉(zhuǎn)染miR-18b mimic后的MDA-MB-231細(xì)胞生長抑制率均升高，即對DDP的化療敏感性升高。結(jié)論 miR-18b通過靶向調(diào)控ATM蛋白增強(qiáng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞對順鉑化療敏感性。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1253533