本文關(guān)鍵詞：新型分泌蛋白Canopy2在結(jié)直腸腺癌生長和發(fā)展中的作用研究

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【摘要】：目的:近年來腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直呈現(xiàn)持續(xù)增高的趨勢,其中血管生成(angiogenesis)是腫瘤生長和發(fā)展的一個重要促進因素。正常情況下,機體內(nèi)促血管生成與抑制血管生成因子之間保持一種動態(tài)平衡,維持血管系統(tǒng)的正常狀態(tài)來保持機體各組織器官正常的營養(yǎng)所需。在腫瘤發(fā)展過程中,由于各種原因?qū)е履[瘤細胞過度增生,為了滿足營養(yǎng)所需,大量的新生血管在瘤體組織中產(chǎn)生,以供給所需的營養(yǎng)物質(zhì),促血管生成因子在此過程發(fā)揮重要的作用。已有研究表明,抑制腫瘤的血管生成,可以有效抑制腫瘤的生長,發(fā)揮一定的抗腫瘤作用�？鼓[瘤血管生成已成為腫瘤治療的新型靶點之一。近期研究表明,Canopy2(CNPY2)是一種新型的分泌型促血管生成因子,具有促進主動脈環(huán)新生血管發(fā)生和生長的效果。因此,CNPY2可能通過促血管生成作用而參與在腫瘤的發(fā)生發(fā)展。結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是人類腫瘤的一類高發(fā)類型,最新數(shù)據(jù)顯示其發(fā)病率和死亡率分別占據(jù)腫瘤疾病的第三和第四位。與其他各類型腫瘤相同,目前結(jié)腸癌的發(fā)病和生長機制仍未明確。課題組在研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的癌組織和血漿中,CNPY2水平顯著增高,提示CNPY2可能參與結(jié)直腸癌生長和發(fā)展,但是確切作用和影響尚不清楚。因此,本課題針對結(jié)直腸癌,研究了CNPY2在結(jié)腸癌生長和發(fā)展中的作用研究。通過使用結(jié)腸癌HCT116細胞,knockdown細胞CNPY2水平,分別在體外細胞和體內(nèi)移植瘤中開展CNPY2在結(jié)直腸癌生物學活性的作用研究,包括腫瘤的生長、遷移/浸潤和凋亡,綜合評價CNPY2作為結(jié)直腸癌的臨床預防或預后評價指標及治療新靶點的開發(fā)應用價值。方法:1.檢測臨床結(jié)直腸癌患者CNPY2表達水平隨機選取臨床結(jié)直腸癌患者,在患者進行手術(shù)切除腫瘤的治療的過程中,收集患者的癌組織和癌旁正常組織(距癌組織15cm)樣品,以及結(jié)直腸腺癌患者術(shù)前和正常健康人的血漿樣品。組織進行RNA、蛋白提取或福爾馬林固定制備石蠟包塊,分別進行人CNPY2的RT-PCR、Western blotting檢測和免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)染色。通過ELISA法,測定血漿CNPY2蛋白的水平。2.構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh RNA質(zhì)粒的HCT116細胞系通過sh RNA(short hairpin RNA)knockdown細胞內(nèi)源性CNPY2基因表達的方式,選擇質(zhì)粒p RFP-C-RS-sh RNA-human CNPY2和p RFP-C-RS-sh RNA-control,采取Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸腫瘤細胞116(human colorectal tumor cell116,HCT116細胞)。細胞培養(yǎng)中采取嘌呤霉素(0.5ug/ml)篩選21天,隨后有限稀釋法進行挑選單個陽性表達質(zhì)粒的細胞、擴增,獲得單細胞克隆。提取細胞RNA、蛋白和培養(yǎng)上清,分別進行RT-PCR、Western blotting和ELISA,檢測細胞內(nèi)源性CNPY2 knockdown的效率。最終成功構(gòu)建兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh RNA質(zhì)粒的細胞系:HCT116sh RNA-CNPY2細胞和HCT116sh RNA-control細胞。3.檢測CNPY2對HCT116細胞部分生物學活性的影響利用構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系HCT116sh RNA-CNPY2細胞和HCT116sh RNA-control細胞,分別采用CCK8細胞計數(shù)法、克隆形成、劃痕愈合試驗、細胞Annexin V和PI雙染流式計數(shù)的方法,觀察CNPY2在HCT116細胞的生長、遷移和凋亡的作用。4.CNPY2對裸鼠移植瘤生長的影響裸鼠皮下等位注射HCT116sh RNA-CNPY2細胞和HCT116sh RNA-control細胞,觀察和記錄移植瘤生長情況。21天后,收集移植瘤,測量瘤體大小、重量反映移植瘤生長情況。移植瘤用于制備石蠟包塊、切片,分別進行增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、CD105和TUNEL染色,反映CNPY2在瘤體增殖、血管生成和凋亡的影響。結(jié)果:1.CNPY2在結(jié)直腸癌癌組織水平明顯高于癌旁正常組織(p0.01),并且CNPY2的來源主要是癌細胞分泌的;患者血漿CNPY2水平是正常健康人的1.72倍(p0.01)。2.成功構(gòu)建了抑制HCT116細胞細胞內(nèi)源性CNPY2表達的sh RNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系HCT116sh RNA-CNPY2細胞及對照細胞系HCT116sh RNA-control細胞。3.體外knockdown CNPY2后,引起細胞增殖和遷移的減弱,而促進化療藥奧沙利鉑誘導的細胞凋亡。4.體內(nèi)瘤體CNPY2的抑制,降低了移植瘤的生長速度和血管生成情況,增加了瘤體的凋亡。結(jié)論:在結(jié)直腸癌的癌組織中癌細胞高表達CNPY2,導致癌組織和患者血漿CNPY2水平明顯高于正常組織和健康人群,提示CNPY2參與結(jié)直腸癌生長和發(fā)展。通過HCT116細胞中開展CNPY2作用研究,CNPY2可能通過促進細胞生長、遷移、血管生成和抑制凋亡,在結(jié)腸癌的生長和浸潤中發(fā)揮作用。通過本研究,闡述了CNPY2引起的結(jié)直腸癌的生物學改變,為后續(xù)與CNPY2有關(guān)的結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機制方面研究指出了方向。臨床結(jié)腸癌患者血漿CNPY2水平的顯著增高,提示CNPY2可能是結(jié)腸癌治療新靶點和評價預后的新指標。此外,CNPY2的下調(diào)引起奧沙利鉑誘導凋亡的增加,對于臨床治療中針對部分耐受化療藥患者的治療研究是具有重要的參考價值的。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

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本文編號：1252082