本文關(guān)鍵詞：Ror2抑制慢性髓系白血病細(xì)胞株K562增殖及其機(jī)制研究

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【摘要】：目的白血病是一種造血干細(xì)胞異常的克隆性疾病,它的治療目前仍以化療為主,但存在毒副作用大的弊端,近來生物治療逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。Wnt信號通路與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),通常認(rèn)為經(jīng)典的Wnt信號(Wnt/β-catenin)是一種促癌通路,而非經(jīng)典Wnt通路是一種抑癌通路,我們前期研究表明Wnt5a作為Wnt家族的一員,它可優(yōu)勢結(jié)合Ror2受體,激活非經(jīng)典通路,進(jìn)而抑制慢性髓系白血病細(xì)胞株K562增殖,預(yù)實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞過表達(dá)Ror2時,出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡,而過表達(dá)Wnt5a時卻沒有發(fā)生細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。本課題旨在進(jìn)一步明確Ror2是否可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡并初步探討其可能的機(jī)制。孤兒受體Ror2在胚胎發(fā)育的早期表達(dá)最高,對組織和器官的形成起著重要的作用。Ror家族在白血病中的報道近年來逐漸增加,但主要是Ror1,如Ror1在人類淋巴細(xì)胞白血病中高表達(dá),是一種致癌因子,但Ror2的報道還非常少。我們曾檢測了26例非惡性血液病和9例急/慢性白血病病例骨髓標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)在白血病病例中,Ror2表達(dá)降低,而非惡性血液病和白血病緩解病例中表達(dá)升高。本研究中發(fā)現(xiàn):過表達(dá)Ror2的K562細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡,提示Ror2在白血病中可能是一種抑癌因子,Ror2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其抑制髓系白血病細(xì)胞增殖的作用之一,其機(jī)制可能與上調(diào)了促凋亡蛋白caspase3、bax,下調(diào)了抗凋亡蛋白survivin、bcl-2有關(guān)。研究方法中,為了制備過表達(dá)Ror2受體的K562細(xì)胞模型,采用了Polybrene促進(jìn)重組腺病毒的轉(zhuǎn)染,高效導(dǎo)入Ror2基因,為改善血液細(xì)胞難轉(zhuǎn)染的難題提供了良好的方法,也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下了良好的基礎(chǔ)。方法1、Polybrene增強(qiáng)重組腺病毒感染K562細(xì)胞效應(yīng)的研究1.1以不同用量的重組腺病毒Ror2(Ad Ror2)感染K562細(xì)胞,求得最佳的重組腺病毒用量。1.2以不同濃度的polybrene和最佳的Ad Ror2用量感染K562細(xì)胞,求得最佳的polybrene用量。1.3以最佳的polybrene濃度和最佳的Ad Ror2用量感染K562細(xì)胞1d、2d、3d、4d、5d,獲得最佳的polybrene感染時間。1.4聯(lián)用最佳的polybrene濃度和最佳的Ad Ror2用量感染K562細(xì)胞后,RT-PCR和Western blot檢測Ror2 m RNA和蛋白的表達(dá)水平。2.Ror2抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的研究2.1 CCK8法檢測Ad Ror2感染K562細(xì)胞后細(xì)胞增殖的變化。2.2用流式細(xì)胞儀分別檢測Ad Ror2感染K562 30h、48h后,細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化。3、Ror2誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡機(jī)制的初步研究3.1 Western blot檢測Ad Ror2感染K562細(xì)胞后,促凋亡蛋白caspase3和bax的表達(dá)。3.2 Western blot檢測Ad Ror2感染K562細(xì)胞后,抗凋亡蛋白survivn和bcl-2的表達(dá)。結(jié)果1、Ad Ror2感染K562細(xì)胞的最佳用量是8μl/105個細(xì)胞;polybrene增強(qiáng)Ad Ror2感染效率的最佳濃度為3μg/ml,最佳作用時間是2d。2、聯(lián)用最佳polybrene濃度和最佳Ad Ror2用量感染K562細(xì)胞2d后,與對照組相比,Ror2在m RNA和蛋白表達(dá)水平均高于對照組。3、Ad Ror2感染K562細(xì)胞1d、2d、3d、4d、5d后,與對照組相比細(xì)胞增殖降低。4、Ad Ror2感染K562細(xì)胞30h、48h后,細(xì)胞周期阻止于G2/M期,與對照組細(xì)胞(34.96±0.16)%相比,其G2/M期的細(xì)胞明顯增高(59.88±0.25)%。細(xì)胞凋亡百分比(13.52±0.48)%高于對照組(10.71±0.50)%。5、Ad Ror2感染K562細(xì)胞2d后,促凋亡蛋白caspase3和bax的表達(dá)均明顯高于對照組;而抗凋亡蛋白survivin和bcl-2的蛋白表達(dá)量均低于對照組。結(jié)論在慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562中,polybrene促進(jìn)了重組腺病毒Ror2感染K562細(xì)胞的效率,解決了K562細(xì)胞難導(dǎo)入基因的難題。過表達(dá)Ror2可明顯抑制K562細(xì)胞的增殖,阻止細(xì)胞于G2/M期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與Ror2參與了上調(diào)促凋亡蛋白caspase3和bcl2的表達(dá),下調(diào)抗凋亡蛋白survivin和bax表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7

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本文編號：1248640