本文關(guān)鍵詞：抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞pl6基因的影響

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【摘要】：目的:運(yùn)用RNAi抑制胃癌細(xì)胞株BGC-823中人DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(Human DNA methylation transferase 1,hDNMT1)基因的表達(dá),當(dāng)DNMT1基因沉默后觀察胃癌細(xì)胞株BGC-823中p16基因的表達(dá)情況。方法:在GenBank中查找hDNMT1的mRNA核苷酸序列,并根據(jù)序列設(shè)計(jì)并合成shRNA序列,以此為模板構(gòu)建siRNA質(zhì)粒1,2,3和陰性對(duì)照siRNA質(zhì)粒b,對(duì)含有質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)并提取出質(zhì)粒,測(cè)量質(zhì)粒濃度后進(jìn)行質(zhì)粒DNA電泳確認(rèn)質(zhì)粒大小。胃癌細(xì)胞培養(yǎng)后接種于六孔培養(yǎng)板中,隔日經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株BGC-823,分轉(zhuǎn)染組(siRNA質(zhì)粒1、2、3)、陰性對(duì)照組siRNA質(zhì)粒b和空白對(duì)照組0,繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,收集轉(zhuǎn)染效率較好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)DNMT1基因行Q-PCR檢測(cè)其mRNA表達(dá)水平及western-blot檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平,確認(rèn)其表達(dá)下調(diào)后篩選出最佳干擾質(zhì)粒。以同樣的方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞最佳干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的p16基因的表達(dá)情況,以確認(rèn)抑制DNMT1基因表達(dá)后對(duì)胃癌細(xì)胞p16基因的影響。結(jié)果:RNAi可有效抑制胃癌細(xì)胞株BGC-823中DNMT1基因的表達(dá),用Q-PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞DNMT1基因檢測(cè)mRNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒2(0.3253±0.0301)的胃癌細(xì)胞中DNMT1的mRNA表達(dá)明顯低于其他轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組(1.0087±0.1584)及空白對(duì)照組(1.8576±0.5603),經(jīng)過(guò)SPSS17.0計(jì)算,P0.05,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對(duì)轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒1(0.7095±0.1154)和siRNA質(zhì)粒3(0.6163±0.1110)的mRNA表達(dá)進(jìn)行比較,經(jīng)過(guò)SPSS17.0計(jì)算,P0.05,結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各轉(zhuǎn)染組的mRNA表達(dá)均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,陰性對(duì)照組的mRNA表達(dá)低于空白對(duì)照組,結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Western Blot法檢測(cè)DNMT1基因蛋白表達(dá)情況,轉(zhuǎn)染siRNA1、2、3的胃癌細(xì)胞DNMT1基因蛋白表達(dá)量分別為0.6772±0.0203、0.5114±0.3866、0.6218±0.0304,結(jié)果與PCR的結(jié)果相似,對(duì)陰性對(duì)照組(0.8135±0.0224)和空白對(duì)照組(0.8164±0.0734)的DNMT1基因蛋白表達(dá)進(jìn)行比較后,P0.05,結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,由此篩選出最佳干擾質(zhì)粒siRNA質(zhì)粒2。分別用Q-PCR、Western Blot方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞最佳干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的p16基因表達(dá)情況,結(jié)果顯示,最佳干擾組的mRNA(1.6727±0.2242)及蛋白(0.9227±0.0337)表達(dá)水平均高于陰性對(duì)照組(1.0025±0.0877)、(0.5440±0.0229)和空白對(duì)照組(0.4729±0.0940)、(0.4767±0.0774),經(jīng)過(guò)SPSS17.0計(jì)算,P0.05,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;比較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的p16蛋白表達(dá)情況,經(jīng)過(guò)SPSS17.0計(jì)算,P0.05,結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:由DNMT1基因引起的抑癌基因p16啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化可能是促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素,用RNAi可以抑制胃癌細(xì)胞DNMT1基因的表達(dá)從而使p16基因去甲基化,使p16恢復(fù)表達(dá),抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展,為臨床治療胃癌提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：1245571