本文關(guān)鍵詞：miR-32靶向DAB2IP對(duì)前列腺癌放療敏感性的調(diào)控機(jī)制研究

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【摘要】：目的:微小RNA(micro RNA,mi RNA)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在不同類型的癌癥細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)mi R-32是前列腺癌(Prostate cancer,PCa)的一個(gè)重要致癌基因,它可以促使前列腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞出現(xiàn)放療抗性,但是mi R-32引起前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生放療抵抗的作用機(jī)制目前基本上是未知的。DOC-2/DAB2交互式蛋白(DAB2IP)在抑制前列腺癌的抗輻射方面起著重要的作用,其作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制細(xì)胞自噬來(lái)提高癌細(xì)胞的放射敏感性。兩種基因在前列腺癌的放射治療中的相關(guān)性未見文獻(xiàn)報(bào)道,本文將研究前列腺癌在放射治療期間mi R-32對(duì)癌細(xì)胞的存活和凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制及mi R-32與DAB2IP在前列腺癌中是否存在靶向關(guān)系,若mi R-32與DAB2IP存在靶向關(guān)系,則進(jìn)一步研究mi R-32與DAB2IP靶向結(jié)合后對(duì)前列腺癌放療敏感性的調(diào)控機(jī)制。方法:第一部分:內(nèi)源檢測(cè)1、分別選取前列腺癌組織4例、癌旁對(duì)照組織2例、良性前列腺增生組織2例,QPCR檢測(cè)其中mi R-32水平;2、分別使用前列腺癌細(xì)胞系PC3、DU145及人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1,QPCR檢測(cè)其中mi R-32水平;3、使用0、2、4、6Gy IR處理PC3、DU145細(xì)胞,QPCR檢測(cè)其中mi R-32水平,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取合適的IR劑量;4、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞中DAB2IP與mi R-32直接靶向關(guān)系。第二部分:功能建模1、分別合成pre-mi R-32和anti-mi R-32,分別轉(zhuǎn)染DU145和PC3的細(xì)胞;2、QPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后mi R-32和DAB2IP m RNA表達(dá)情況變化;3、WB檢測(cè)功能模型中DAB2IP表達(dá)水平變化;分組:Con、pre-con、pre-mi R-32、anti-con、anti-mi R-32第三部分:功能實(shí)驗(yàn)1、The SF analysis實(shí)驗(yàn)檢測(cè)放療敏感性變化,使用IR處理PC3、DU145功能模型細(xì)胞分組:Con、pre-con、pre-mi R-32、anti-con、anti-mi R-32IR濃度:0、2、4、6Gy2、IR誘發(fā)的自噬檢測(cè),用2Gy IR處理細(xì)胞,處理后24h WB檢測(cè)LC3B I/II、Beclin 1蛋白表達(dá)水平的變化以反映細(xì)胞自噬能力的改變;分組:Con、pre-con、pre-mi R-32、anti-con、anti-mi R-323、IR誘發(fā)的流式凋亡檢測(cè),用2Gy IR處理細(xì)胞后,流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡;分組1:Con、pre-con、pre-mi R-32、anti-con、anti-mi R-32分組2:con、pre-con、pre-mi R-32、pre-con+BFA(4n M)、pre-mi R-32+BFA(4n M);4、利用Talen敲除前列腺癌細(xì)胞中的DAB2IP,建穩(wěn)株;5、用2Gy IR處理PC3-DAB(-)和DU145-DAB(-)細(xì)胞,處理后24h,WB檢測(cè)自噬相關(guān)因子LC3B I/II、Beclin 1分組:con、pre-con、pre-mi R-32、anti-con、anti-mi R-326、IR誘發(fā)的流式凋亡檢測(cè),用2Gy IR處理細(xì)胞后,流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡;分組:con、pre-con、pre-mi R-32、pre-con+BFA(4n M)、pre-mi R-32+BFA(4n M)第四部分:信號(hào)通路研究:1、WB檢測(cè)常規(guī)前列腺癌細(xì)胞中DAB2IP、pm TOR、m TOR、p S6K、LC3B和Beclin 1表達(dá)水平變化分組:Con、pre-con、pre-mi R-32、anti-con、anti-mi R-32結(jié)果:通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)mi R-32在前列腺癌細(xì)胞中可通過(guò)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬及抑制放療所誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞的凋亡來(lái)對(duì)抗放射線的損害。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)DAB2IP是一種mi R-32依賴性的腫瘤抑制基因,mi R-32在前列腺癌細(xì)胞中通過(guò)與DAB2IP 3'非編碼區(qū)域內(nèi)的直接結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而呈上調(diào)或過(guò)度表達(dá)狀態(tài),同時(shí)抑制DAB2IP在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。在前列腺癌細(xì)胞中加入mi R-32 mimics模擬物,可觀察到前列腺癌細(xì)胞在IR作用下的存活率明顯增強(qiáng),這可能是由于mi R-32可以逆轉(zhuǎn)IR對(duì)前列腺癌細(xì)胞的損傷,致使前列腺癌細(xì)胞對(duì)放療射線的敏感性下降。通過(guò)流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)前列腺癌細(xì)胞中mi R-32過(guò)表達(dá)和DAB2IP被敲除后,經(jīng)過(guò)IR誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞的凋亡明顯受到了抑制,但在上訴前列腺癌細(xì)胞株中加入4nm的BFA(Brefeldin A)(BFA為自噬抑制劑,可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,在前列腺癌中靶向抑制細(xì)胞周期)后,前列腺癌細(xì)胞的凋亡率可恢復(fù)到正常水平。上面所訴的mi R-32過(guò)表達(dá)和DAB2IP被敲除后的前列腺癌細(xì)胞被IR處理后該細(xì)胞的自噬增強(qiáng)更為顯著。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)Mi R-32可以調(diào)控自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),如DAB2IP、自噬基因Beclin 1、LC3B I/II以及磷酸化S6K(p S6K)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)等�？傊�,這些研究數(shù)據(jù)可為mi R-32靶向DAB2IP對(duì)調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)和抗輻射機(jī)制提供新的見解,可能會(huì)為前列腺癌的治療做出新的貢獻(xiàn)。結(jié)論:1、mi R-32與前列腺癌細(xì)胞放療抗性的出現(xiàn)有關(guān);2、mi R-32與DAB2IP在前列腺癌細(xì)胞中存在直接的靶向關(guān)系;3、mi R-32靶向DAB2IP對(duì)自噬的介導(dǎo)可能是通過(guò)m TOR-p S6K信號(hào)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.25

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1 尹朝發(fā);miR-32靶向DAB2IP對(duì)前列腺癌放療敏感性的調(diào)控機(jī)制研究[D];南華大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1242493