本文關(guān)鍵詞：死亡受體5在結(jié)腸癌組織的表達(dá)及抗死亡受體5新型人源抗體的篩選和鑒定

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【摘要】：[背景]近年來,罹患結(jié)腸癌的患者越來越多。雖然目前臨床診療技術(shù)逐步提高,手術(shù)方式日趨完善,化療、放療等輔助綜合手段不斷發(fā)展,但結(jié)腸癌的治愈率和術(shù)后5年生存率并沒有得到顯著的提高。近些年來,腫瘤生物免疫療法受到大家越來越多的關(guān)注,其具有靶向性、高效性及低毒性等優(yōu)勢,不久的將來有可能成為對抗腫瘤的一把新利器,在治療中占據(jù)主導(dǎo)地位。死亡受體5 (death receptor 5, DR5)屬于腫瘤壞死因子受體(Tumor Necrosis Factor receptor, TNFR)超家族成員,主要分布于多種腫瘤細(xì)胞的表面,在正常細(xì)胞很少或幾乎不表達(dá),當(dāng)DR5與其配體腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)結(jié)合后,激活caspase-3,特異性誘導(dǎo)敏感腫瘤細(xì)胞凋亡,這些特性使得DR5成為腫瘤生物治療的重要靶點。噬菌體抗體庫技術(shù)是20世紀(jì)90年代建立的一種制備人源抗體的新技術(shù)。該技術(shù)繞過了以往單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)研制過程中必經(jīng)的雜交瘤途徑,甚至不需要經(jīng)過免疫。隨著雅培公司運用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)獲得的治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的全人源抗體Humira等進(jìn)入市場,噬菌體抗體庫技術(shù)已成為研發(fā)治療性抗體的重要平臺。[研究目的]免疫組織化學(xué)法探究DR5在正常結(jié)腸、結(jié)腸管狀腺瘤以及結(jié)腸管狀腺癌三者間的表達(dá)情況有無差異；在結(jié)腸管狀腺癌中的表達(dá)是否與性別、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理大體分型、組織學(xué)分型及TNM臨床預(yù)后分期有關(guān)。初步判斷DR5能否作為腫瘤生物免疫治療中一個潛在的良好靶點,是否與腫瘤的臨床病理特征相關(guān),為未來腫瘤的個體化治療及相關(guān)抗體藥物的臨床試驗提供初步線索。然后從大容量天然噬菌體抗體庫中篩選抗DR5人源單鏈抗體(single chain Fv, scFv)并對其抗原結(jié)合活性進(jìn)行鑒定,為進(jìn)一步研究該抗體抗腫瘤的生物免疫學(xué)作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。[研究方法]應(yīng)用HE染色確認(rèn)實驗樣本的病理學(xué)診斷,免疫組織化學(xué)方法檢測DR5在正常結(jié)腸、結(jié)腸管狀腺瘤、結(jié)腸管狀腺癌以及結(jié)腸黏液腺癌中的表達(dá)情況；以前期真核表達(dá)純化的DR5-Fc蛋白包被篩選管,從自主構(gòu)建的大容量天然噬菌體抗體庫中,通過4輪篩選過程獲得噬菌體抗體,通過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)獲得可溶性抗體,采用ELISA、免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫組織化學(xué)法鑒定抗體的抗原結(jié)合活性,DNA指紋圖譜分析和序列測定確定其抗體類型。[實驗結(jié)果]1.DR5在正常結(jié)腸、結(jié)腸管狀腺瘤及結(jié)腸管狀腺癌組織中的表達(dá)結(jié)腸正常組織中DR5的表達(dá)較結(jié)腸管狀腺瘤和結(jié)腸管狀腺癌均低,結(jié)腸管狀腺癌以及結(jié)腸管狀腺瘤組織中DR5相對高表達(dá),但管狀腺癌與腺瘤之間DR5的表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異。2.DR5的表達(dá)水平與結(jié)腸管狀腺癌臨床病理特征的關(guān)系DR5在結(jié)腸管狀腺癌組織中的表達(dá)情況與患者的性別、腫瘤的大小、大體類型、組織學(xué)分型、浸潤分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯關(guān)系,僅僅與腫瘤的TNM臨床預(yù)后分期有關(guān),DR5在結(jié)腸管狀腺癌晚期及終末期(Ⅲ、Ⅳ期)中的表達(dá)較早中期(ⅠⅡ期)有明顯的下降趨勢。3.利用大型天然噬菌體抗體庫篩選抗死亡受體5人源抗體經(jīng)過4輪篩選,噬菌體抗體得到明顯富集。從后兩輪庫中隨機(jī)挑選80個單菌落,噬菌體誘導(dǎo)表達(dá)。ELISA檢測,結(jié)果顯示有59個與DR5-Fc有結(jié)合活性,陽性率為73.6%,其中特異性結(jié)合的克隆為46個。46個噬菌體陽性克隆制備可溶性scFv,其中有26個克隆與DR5-Fc特異性結(jié)合。4.對陽性克隆的進(jìn)一步分析26個陽性克隆的DNA MvaⅡ酶切后聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示,共獲得了4種不同的指紋圖譜。對4種不同陽性克隆測序結(jié)果分析,4個抗體基因來源于不同的胚系,其中輕鏈可變區(qū)同屬于VK3、VL1、VL2亞群,而重鏈可變區(qū)基因分屬VH1,VH3亞群。5.細(xì)胞ELISA、免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫組織化學(xué)鑒定篩選抗體的抗原結(jié)合活性4種陽性克隆的噬菌體抗體及可溶性抗體均能與細(xì)胞中表達(dá)的DR5蛋白特異性結(jié)合。[實驗結(jié)論]：1.DR5在正常結(jié)腸組織中低表達(dá),在結(jié)腸癌組織中高表達(dá),兩者的表達(dá)情況有顯著性差異性,提示DR5具備成為腫瘤未來生物免疫治療中一個潛在的良好靶點。2.DR5在結(jié)腸管狀腺瘤中的表達(dá)較正常結(jié)腸組織有明顯升高的趨勢,提示DR5在癌前病變形成早期可能發(fā)揮著一定的作用。3.DR5在結(jié)腸管狀腺癌早中期有著高表達(dá),而在晚期及終末期癌組織的表達(dá)量有明顯下降的趨勢,這為未來DR5抗體藥物的臨床試驗及腫瘤的個體化治療提供了初步線索。4.利用新型大容量天然噬菌體抗體庫,通過篩選及鑒定能快速獲得特異性抗DR5人源scFv。5.4種基因型陽性克隆的噬菌體抗體及可溶性抗體具備良好的細(xì)胞結(jié)合活性。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35

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本文編號：1242081