本文關(guān)鍵詞：CDK抑制劑SNS-032對急性髓系白血病的殺傷作用及機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景 急性髓細(xì)胞白血病(AML)是造血細(xì)胞惡性克隆性病變,其特點(diǎn)是白血病細(xì)胞在骨髓顯著增生,抑制正常造血。成人AML的發(fā)生率明顯高于急性淋巴細(xì)胞白血病,是最常見的急性白血�。徊㈦S年齡的增長而增加。目前采用聯(lián)合化療、造血干細(xì)胞移植等手段延長患者生存期,但仍有很大一部分患者無法耐受大劑量化療副作用,或使用常規(guī)藥物無效,最終復(fù)發(fā)。惡性腫瘤靶向藥物研究是白血病治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),目前已有多種小分子抑制劑治療AML進(jìn)入臨床研究。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)在調(diào)控細(xì)胞周期和基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用,AML常有CDK活性異常增高,因此CDK抑制劑可能在治療AML中發(fā)揮重要作用。 目的 1、研究CDK抑制劑SNS-032在體外對AML細(xì)胞株的生長抑制作用； 2、研究小分子抑制劑SNS-032對AML細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用； 3、研究白細(xì)胞介素6能否逆轉(zhuǎn)SNS-032對AML的殺傷作用,從而克服耐藥； 4、通過基因芯片和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)研究SNS-032對白血病細(xì)胞殺傷的分子機(jī)制。 方法 1、臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性。收集藥物處理后的細(xì)胞,臺盼藍(lán)染色后,通過顯微鏡下直接計數(shù),就可以對細(xì)胞存活率進(jìn)行比較精確的定量。 2、應(yīng)用MTT法,檢測SNS-032對白血病細(xì)胞株生長抑制作用。 3、應(yīng)用流式細(xì)胞儀,檢測SNS-032作用后白血病細(xì)胞的凋亡情況。 4、基因芯片分析miRNA,檢測SNS-032作用前后microRNA (miRNA)表達(dá)水平。 5、應(yīng)用Western blot,檢測SNS-032作用后JAK2/STAT3蛋白和CDK下游抗凋亡蛋白Mcl-1和c-myc表達(dá)情況以及IL-6對試驗(yàn)組JAK2/STST3蛋白表達(dá)的影響。 6、統(tǒng)計分析,應(yīng)用Prime4軟件統(tǒng)計,比較采用Dunnett-t法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、 SNS-032對人AML不同細(xì)胞株的生長抑制作用：我們采用臺盼藍(lán)染色,通過人AML細(xì)胞株用藥前及不同濃度下用藥24h、48h后的拒染率分析,闡述不同人AML細(xì)胞株對SNS-032作用的反應(yīng)。SNS-032濃度分別為25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L,結(jié)果顯示,SNS-032對各細(xì)胞株均有生長抑制作用,且呈濃度依賴性；其中MV4-11、U937細(xì)胞株生長抑制尤為明顯,MV4-11細(xì)胞株24小時100nmol/L藥物作用后平均拒染率為67.3%,48小時拒染率為53%,U937細(xì)胞株24小時100nmol/L藥物作用后平均拒染率為71.7%,48小時拒染率為53.4%。 2、 SNS-032對人AML細(xì)胞株的誘導(dǎo)凋亡作用：采用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度SNS-032(100nmol/L、200nmol/L)作用于人AML細(xì)胞株24h,細(xì)胞的數(shù)量百分比變化,結(jié)果顯示,SNS-032為100nmmol/L時,細(xì)胞凋亡率達(dá)12.1%,當(dāng)SNS-032為200nmmol/L時凋亡率達(dá)59.4%,提示凋亡細(xì)胞呈濃度依賴性。 3、 SNS-032對人AML細(xì)胞株miRNA的影響：應(yīng)用microRNA(miR)芯片分析SNS-032作用前后miR的差異表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),SNS-032顯著下調(diào)miR-30a、miR-183、miR-20b、miR-20a、miR-589、miR-107、miR-181a、 miR-106a、miR-17、miR-378c的表達(dá)水平,顯著上調(diào)has-miR-320a。 4、 SNS-032對JAK/STST3途徑相關(guān)蛋白的抑制作用：應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測SNS-032對JAK/STAT3蛋白表達(dá)的作用,結(jié)果顯示SNS-032顯著抑制JAK蛋白表達(dá),抑制STAT3的磷酸化水平。此外,SNS-032對CDK下游抗凋亡蛋白Mcl-1和c-myc也有顯著的抑制作用。 5、(5)IL-6對SNS-032對白血病細(xì)胞作用的影響：應(yīng)用Western-blot技術(shù),對試驗(yàn)組聯(lián)合IL-6進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)IL-6在HL-60細(xì)胞組可輕度上調(diào)JAK2和磷酸化STAT3,但不能逆轉(zhuǎn)SNS-032對其的抑制作用,但在KG-1細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)中IL-6輕度上調(diào)JAK2,明顯激活STAT3,聯(lián)合用藥后能部分逆轉(zhuǎn)對STAT3的激活作用。 結(jié)論 1、 SNS-032對多種人AML細(xì)胞株有生長抑制作用,呈時間-劑量依賴性。 2、 IL-6不能逆轉(zhuǎn)SNS-032對AML細(xì)胞株HL-60的生長抑制作用,提示其可以克服耐藥。 3、新型CDK抑制劑SNS-032能誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡,濃度為200nM是能顯著誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。 4、 SNS-032顯著下調(diào)HL-60細(xì)胞miR-30a、miR-183、miR-20b、miR-26b、 miR-20a、miR-589、miR-107、miR-181a、miR-106a、miR-17和miR-378c的表達(dá)水平,顯著上調(diào)hsa-miR-320a和miR-H7* 5、 SNS-032能顯著抑制JAK/STAT3途徑相關(guān)蛋白和CDK下游抗凋亡蛋白Mcl-1和c-myc的表達(dá)。 6、HL-60細(xì)胞株中SNS-032對JAK/STAT3的抑制作用不被IL-6逆轉(zhuǎn)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Synthesis and antitumor activity of 7-azaindirubin[J];Chinese Chemical Letters;2009年05期

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本文編號：1238687