本文關(guān)鍵詞：TLR4在肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化及其調(diào)控機(jī)制的研究

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【摘要】：目的：研究TLR4是否參與肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化；闡明TLR4在肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化中的重要作用及其調(diào)控機(jī)制；探討TLR4在肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)肺癌進(jìn)展的影響中所起的作用。方法：1. Kaplan-Meier Plotter軟件分析臨床肺癌病人生存率與TLR4和CD68的相關(guān)性；免疫熒光檢測(cè)臨床肺癌病人與對(duì)應(yīng)病人正常組織樣本中TLR4和CD68的表達(dá)。2.C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠皮下接種LLC小鼠肺癌細(xì)胞株,比較TLR4敲除組與對(duì)照組細(xì)胞原發(fā)灶小鼠成瘤大��；免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子F4/80,M1型標(biāo)記分子INOS, M2型標(biāo)記分子Argl的表達(dá)變化。3. Real time PCR 及 Western Blot方法檢測(cè)C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠皮下腫瘤組織中M1型細(xì)胞標(biāo)記分子如INOS、TNF-α、IL-1β、IL-6等和M2型細(xì)胞標(biāo)記分子如Arg1、IL-10、MRC1等的表達(dá)變化,探討TLR4對(duì)肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響。4.轉(zhuǎn)染RAW264.7小鼠肺巨噬細(xì)胞株使TLR4表達(dá)抑制,建立TLR4敲減的RAW264.7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,采用Real time PCR及Western Blot方法檢測(cè)干擾效率；Real time PCR方法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞敲減TLR4后,利用條件性培養(yǎng)基LCM刺激,糖酵解相關(guān)因子如SLC2A1、 HK1、 PFKP、PKM2、Aldolase、 LDH-5α等；ATP、乳酸測(cè)定法檢測(cè)ATP及乳酸含量的變化。5.分離小鼠皮下腫瘤中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,進(jìn)行Western-Blot、Real time PCR檢測(cè)動(dòng)物水平上糖酵解相關(guān)因子如SLC2A1、 HK1、PFKP、PKM2、Aldolase、 LDH-5α及相關(guān)蛋白P-AKT、P-mTOR、 HIF-1α、Bcl-6的表達(dá)變化。ATP、乳酸測(cè)定法檢測(cè)ATP及乳酸含量的變化。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞敲減TLR4后,利用條件性培養(yǎng)基LCM刺激,線粒體數(shù)量、功能以及線粒體ROS的表達(dá)變化。7. Western-Blot方法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞敲減TLR4以及皮下腫瘤組織分離的TAM中影響糖酵解途徑的相關(guān)蛋白p-AKT、p-mTOR、HIF-1α、Bcl-6的表達(dá)變化,探討TLR4在肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化中的調(diào)控機(jī)制。8. 免疫組化方法檢測(cè)C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠皮下腫瘤組織中增殖相關(guān)蛋白Ki67、PCNA的表達(dá)變化。分離小鼠皮下腫瘤中的LLC細(xì)胞,進(jìn)行MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠中,對(duì)于Gefitinib誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性的變化；TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠中LLC細(xì)胞的凋亡變化；體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠中LLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化；腫瘤球?qū)嶒?yàn)和軟瓊脂實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠中LLC細(xì)胞的腫瘤干性及克隆形成率,探討TLR4在肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)肺癌進(jìn)展影響中所起的作用。9.構(gòu)建pGL3-HIF-1α promoter報(bào)告基因質(zhì)粒,將Bcl-6過表達(dá)質(zhì)粒與重組報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入RAW264.7細(xì)胞,檢測(cè)雙熒光素酶活性。研究HIF-1α與Bcl-6的相關(guān)性,探討TLR4在肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化中的分子調(diào)控機(jī)制。結(jié)果：1. 臨床肺癌病人生存率與TLR4及CD68的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)；臨床肺癌病人標(biāo)本中TLR4表達(dá)量異常高,尤其是在CD68標(biāo)記的肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞。2.TLR4敲除組與對(duì)照組細(xì)胞相比原發(fā)灶小鼠成瘤顯著減小。3.TLR4-/-小鼠腫瘤組織中M1型標(biāo)記分子如INOS、 TNF-α、IL-41β、IL-6顯著上調(diào)；C57BL/6小鼠腫瘤組織中M2型標(biāo)記分子如Arg1、L-10、MRC1顯著上調(diào)。4.TLR4表達(dá)量在RAW264.7敲減細(xì)胞中顯著下調(diào)；穩(wěn)定敲減TLR4的RAW264.7細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,糖酵解相關(guān)因子如SLC2A1、HK1、PFKP、PKM2、 Aldolase、LDH-5α表達(dá)量顯著上調(diào)；ATP含量顯著下調(diào),乳酸含量顯著上調(diào)。5.RAW264.7細(xì)胞敲減TLR4后,與對(duì)照組相比,線粒體數(shù)量、功能及線粒體ROS的表達(dá)量顯著下調(diào)。6.TLR4-/-小鼠和C57BL/6小鼠相比,皮下腫瘤組織中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,M1型標(biāo)記分子如INOS、TNF-α、IL-1β、IL-6顯著上調(diào),M2型標(biāo)記分子如Arg1、 IL-10、MRC1顯著下調(diào)。糖酵解相關(guān)因子如SLC2A1、 HK1、PFKP、PKM2、 Aldolase、 LDH-5α表達(dá)量顯著上調(diào)；ATP含量顯著下調(diào),乳酸含量顯著上調(diào)。7.穩(wěn)定敲減TLR4的RAW264.7細(xì)胞以及皮下腫瘤組織中的TAM,影響糖酵解途徑的相關(guān)蛋白p-AKT、p-mTOR、Bcl-6的表達(dá)量顯著上調(diào),HIF-1α的表達(dá)量顯著下調(diào)。8.與C57BL/6小鼠相比,TLR4-/-小鼠皮下腫瘤組織中增殖相關(guān)蛋白Ki67、PCNA顯著下調(diào)；皮下腫瘤組織中的LLC細(xì)胞,對(duì)于Gefitinib誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性降低,細(xì)胞凋亡數(shù)量增加；LLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著下降,同時(shí)抑制了LLC細(xì)胞的腫瘤干性以及生長(zhǎng)速度。9.TLR4對(duì)Bcl-6具有靶向調(diào)控作用,能通過激活A(yù)KT-mTOR通路顯著增強(qiáng)Bcl-6的表達(dá),從而抑制HIF-1α的表達(dá)。結(jié)論：1.肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞中TLR4呈現(xiàn)顯著高表達(dá)。2.TLR4參與了肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化的調(diào)控,能夠通過促進(jìn)線粒體代謝中的氧化磷酸化過程以及抑制糖酵解途徑來促使肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞趨向于M2型極化；3.TLR4能夠通過調(diào)控肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲、遷移、生長(zhǎng)。4.TLR4通過激活A(yù)KT-mTOR通路特異性靶向Bcl-6分子,從而發(fā)揮對(duì)HIF-1α起抑制作用；
【學(xué)位授予單位】：杭州師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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