本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞自噬在門(mén)冬酰胺酶殺傷肺腺癌細(xì)胞中的作用和機(jī)制的研究

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【摘要】：研究背景支氣管肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,支氣管肺癌按照生物特性、治療方式及預(yù)后通常分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩類。肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌中最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型,同時(shí)也是發(fā)生于非吸煙者的最常見(jiàn)細(xì)胞學(xué)類型。因?yàn)榉蜗侔┚哂邪l(fā)病率高、預(yù)后差、致死率高的特點(diǎn),人們開(kāi)始關(guān)注以細(xì)胞代謝為靶點(diǎn)(如天冬酰胺)的治療策略在肺腺癌治療中所發(fā)揮的作用。以天冬酰胺為靶點(diǎn)的門(mén)冬酰胺酶是目前FDA批準(zhǔn)最有效的抗腫瘤酶制劑之一主要治療急性淋巴系白血病和某些髓系白血病的亞型。我們的研究首次報(bào)導(dǎo)門(mén)冬酰胺酶對(duì)肺腺癌的細(xì)胞毒作用并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞內(nèi)高度保守的長(zhǎng)壽蛋白和細(xì)胞器的降解和再循環(huán)機(jī)制,對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞增殖、分化及死亡等過(guò)程意義重大,并且與疾病治療尤其是腫瘤治療密切相關(guān)�，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)氨基酸缺乏,例如精氨酸的剝奪可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象。但是門(mén)冬酰胺酶是否可誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬尚未有報(bào)道,我們首次報(bào)導(dǎo)了門(mén)冬酰胺酶能夠誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞A549和H1975發(fā)生細(xì)胞自噬,并且本實(shí)驗(yàn)還對(duì)細(xì)胞自噬在門(mén)冬酰胺酶殺傷肺腺癌細(xì)胞中的作用和相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了研究。研究目的1.本項(xiàng)課題探究了靶向細(xì)胞自噬和天冬酰胺的策略用于肺腺癌治療的潛力,我們?cè)噲D探討門(mén)冬酰胺酶能否降解肺腺癌A549和H1975細(xì)胞胞外的天冬酰胺,并顯著抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡。2.天冬酰胺剝奪是否能誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生以自噬流(包括自噬體的形成、自噬體和溶酶體的融合、自噬體的降解三大階段)為表征的細(xì)胞自噬。并且抑制細(xì)胞自噬可否顯著提高門(mén)冬酰胺酶對(duì)肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。3.我們?cè)噲D探究門(mén)冬酰胺酶對(duì)肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用同細(xì)胞自噬間的關(guān)系,并且評(píng)估了氧自由基在門(mén)冬酰胺酶殺傷肺腺癌細(xì)胞中的作用。本實(shí)驗(yàn)試圖研究細(xì)胞自噬在天冬酰胺酶殺傷肺腺癌細(xì)胞中充當(dāng)?shù)慕巧?靶向自噬和天冬酰胺的策略能否成為肺腺癌治療的新型方案。研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.A549和H1975細(xì)胞對(duì)門(mén)冬酰胺酶的敏感性與天冬酰胺合成酶缺陷有關(guān)。既往研究顯示天冬酰胺合成酶缺陷的腫瘤細(xì)胞對(duì)天冬酰胺剝奪治療策略敏感,因此我們使用western blot分析兩株肺腺癌細(xì)胞的天冬酰胺合成酶(Asparagine synthetase,ASNS)蛋白表達(dá)情況。分別抽提A549、H1975、K562及Jurkat細(xì)胞的總蛋白,用western blot分析,結(jié)果顯示,K562細(xì)胞表達(dá)天冬酰胺合成酶(ASNS)蛋白,而A549、H1975及Jurkat細(xì)胞不表達(dá)天冬酰胺合成酶(ASNS)蛋白。2.門(mén)冬酰胺酶對(duì)A549和H1975細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。使用不同濃度的門(mén)冬酰胺酶處理A549和H1975細(xì)胞72h,采用MTT法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力。我們可以觀察到門(mén)冬酰胺酶以濃度依賴的方式顯著抑制肺腺癌細(xì)胞A549和H1975的細(xì)胞生長(zhǎng)。3.門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)A549和H1975細(xì)胞的凋亡。我們運(yùn)用Annexin V/PI雙標(biāo)記染色的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。兩株肺腺癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度的門(mén)冬酰胺酶處理后,凋亡細(xì)胞所占的比率隨門(mén)冬酰胺酶濃度的增加而增多。4.門(mén)冬酰胺酶能激活A(yù)549和H1975細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬。我們采用透射電子顯微鏡、western blot和免疫熒光三種手段檢測(cè)自噬發(fā)生。首先,我們用門(mén)冬酰胺酶(1IU/mL)分別處理A549和H1975細(xì)胞,48h后收集并固定細(xì)胞,對(duì)兩株細(xì)胞進(jìn)行包埋、切片及染色處理在透射電子顯微鏡下觀察它們的超微結(jié)構(gòu)。未經(jīng)門(mén)冬酰胺酶處理的空白對(duì)照組的肺腺癌細(xì)胞A549和H1975鏡下細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,其細(xì)胞核及核仁清楚；而經(jīng)門(mén)冬酰胺酶(1IU/mL)處理48h后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞核固縮變形,在高倍鏡下可見(jiàn)明顯的雙層膜結(jié)構(gòu)。與空白對(duì)照組相比,門(mén)冬酰胺酶能顯著誘導(dǎo)兩株肺腺癌細(xì)胞自噬體的形成。然后,我們利用western blot技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的變化。用0.25、0.5及1.0IU/mL門(mén)冬酰胺酶處理兩株肺腺癌細(xì)胞48h或者門(mén)冬酰胺酶(1IU/mL)處理A549和H1975細(xì)胞6h、12h及24h,分別抽提蛋白檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的變化情況。門(mén)冬酰胺酶能明顯誘導(dǎo)兩株肺腺癌細(xì)胞LC3 Ⅱ的表達(dá)量增加并且具有劑量和時(shí)間依賴性,說(shuō)明門(mén)冬酰胺酶能明顯誘導(dǎo)A549和H1975細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬。另一方面,為了進(jìn)一步研究門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)兩株肺腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬的作用,本實(shí)驗(yàn)還使用了熒光標(biāo)記的方法觀測(cè)細(xì)胞自噬流的發(fā)生。Cyto-ID(?)染料是專門(mén)用于細(xì)胞自噬檢測(cè)的染料,它能特異性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白并產(chǎn)生綠色熒光。實(shí)驗(yàn)組A549和H1975細(xì)胞分別用1IU/mL門(mén)冬酰胺酶處理12h、24h及48h,預(yù)處理完成后用Hoechst33342染細(xì)胞核(藍(lán)),Cyto-ID Green Dye指示自噬體(綠),LysoTracker Red DND 99染溶酶體(紅)。我們通過(guò)熒光顯微鏡可以發(fā)現(xiàn)門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)兩株肺腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬流的三個(gè)階段：第12h自噬體形成(綠色),第24h自噬體和溶酶體發(fā)生融合(黃色),第48h自噬體被溶酶體降解(橙色),結(jié)果顯示天冬酰胺耗竭可以誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬流。5.自噬抑制劑氯喹與門(mén)冬酰胺酶聯(lián)用增加肺腺癌細(xì)胞LC3 Ⅱ蛋白的表達(dá)。為了探究自噬在門(mén)冬酰胺酶殺傷肺腺癌細(xì)胞A549和H1975中的作用,本研究采用自噬抑制劑氯喹抑制門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。氯喹作為自噬抑制劑,可以通過(guò)提高胞質(zhì)的pH值在自噬終末階段阻止自噬體同溶酶體的融合,導(dǎo)致自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ的過(guò)表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示門(mén)冬酰胺酶能引起A549和H1975細(xì)胞中LC3 Ⅱ的表達(dá)量增加,而聯(lián)用氯喹能上調(diào)門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)的LC3 Ⅱ的表達(dá),表明氯喹能有效抑制門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。6.自噬抑制劑氯喹增強(qiáng)門(mén)冬酰胺酶對(duì)肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。使用自噬抑制劑氯喹與門(mén)冬酰胺酶聯(lián)合或單獨(dú)使用門(mén)冬酰胺酶處理A549和H1975細(xì)胞72h,采用MTT法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力。細(xì)胞活力以570nm波長(zhǎng)下測(cè)定的吸光值換算成的存活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與單獨(dú)使用門(mén)冬酰胺酶處理組相比,自噬抑制劑氯喹與門(mén)冬酰胺酶聯(lián)合使用可顯著增強(qiáng)門(mén)冬酰胺酶對(duì)A549和H1975細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。7.使用siRNA特異性沉默自噬相關(guān)蛋白ATG5。為深入探究抑制細(xì)胞自噬強(qiáng)化門(mén)冬酰胺酶殺傷肺腺癌細(xì)胞的作用,本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾技術(shù)特異性沉默細(xì)胞自噬相關(guān)基因5(ATGS)的表達(dá),并在此基礎(chǔ)上研究抑制細(xì)胞自噬對(duì)門(mén)冬酰胺酶抑制A549和H1975細(xì)胞生長(zhǎng)作用的影響。我們采用siRNA-ATG5-1/siRNA-ATG5-2選擇性下調(diào)ATG5,Western blot顯示,同si-Contorl干擾組相比,siRNA-ATG5-1/siRNA-ATG5-2干擾組ATG蛋白的表達(dá)量明顯減少,說(shuō)明si-ATG5成功沉默了ATG5的表達(dá)。8.使用siRNA沉默自噬相關(guān)蛋白ATG5能顯著增強(qiáng)門(mén)冬酰胺酶對(duì)A549和H1975細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。在上述基礎(chǔ)上,MTT結(jié)果顯示,與si-Control干擾組的門(mén)冬酰胺酶對(duì)A549和H1975細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用相比,siRNA-ATG5-1/siRNA-ATG5-2干擾組能明顯提高門(mén)冬酰胺酶對(duì)兩株肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。9.抑制細(xì)胞自噬可增強(qiáng)門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)A549和H1975細(xì)胞發(fā)生凋亡作用。我們探討門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的關(guān)系,首先使用自噬抑制劑氯喹聯(lián)合門(mén)冬酰胺酶預(yù)處理A549和H1975細(xì)胞24h,收集細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示,單獨(dú)使用門(mén)冬酰胺酶組細(xì)胞凋亡率分別是14.7%和18.9%,而自噬抑制劑氯喹和門(mén)冬酰胺酶共同作用組誘導(dǎo)AnnexinV陽(yáng)性的細(xì)胞比例增加,A549和H1975細(xì)胞的凋亡率分別是32%和47%。說(shuō)明自噬抑制劑氯喹抑制細(xì)胞自噬能明顯增強(qiáng)門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)兩株肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。10.自噬抑制劑氯喹和門(mén)冬酰胺酶聯(lián)用能增強(qiáng)caspase3的活性。自噬抑制劑氯喹聯(lián)合門(mén)冬酰胺酶處理A549和H1975細(xì)胞48h,或者單獨(dú)使用門(mén)冬酰胺酶或氯喹處理兩株細(xì)胞48h,然后使用caspase3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組caspase3活性。同空白對(duì)照組相比,自噬抑制劑氯喹聯(lián)合門(mén)冬酰胺酶組的caspase3活性顯著提高。11.z-VAD-fink能顯著減弱門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制。使用caspase廣譜抑制劑z-VAD-frnk與門(mén)冬酰胺酶及自噬抑制劑聯(lián)合使用或單獨(dú)處理兩株肺腺癌細(xì)胞,運(yùn)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化。同單獨(dú)使用門(mén)冬酰胺酶處理組或氯喹聯(lián)合門(mén)冬酰胺酶處理組相比,運(yùn)用z-VAD-fink抑制caspase的剪切后,門(mén)冬酰胺酶對(duì)A549和H1975細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用明顯減弱。綜上所述,抑制自噬能增強(qiáng)門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)的A549和H1975細(xì)胞的caspase3依賴的凋亡。12.N-乙酰半胱氨酸(N-acety-cysteine,NAC)抑制門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)肺腺癌發(fā)生細(xì)胞自噬和線粒體產(chǎn)生氧自由基。為了探究氧自由基在門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬和細(xì)胞毒作用中所扮演的角色,我們使用抗氧化劑NAC和門(mén)冬酰胺酶聯(lián)合處理A549和H1975細(xì)胞48h,然后分別使用Mitosox、Cyto-ID標(biāo)記線粒體氧自由基和自噬體。門(mén)冬酰胺酶處理組中紅色熒光提示線粒體氧自由基的產(chǎn)生,綠色熒光提示自噬體形成,而抗氧化劑NAC和門(mén)冬酰胺酶聯(lián)合處理組中紅色熒光和綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱,提示抑制氧自由基能減弱門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)A549和H1975細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬的作用。13.清除氧自由基削弱門(mén)冬酰胺酶對(duì)肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。我們利用抗氧化劑NAC和門(mén)冬酰胺酶處理A549和H1975細(xì)胞,或者門(mén)冬酰胺酶單獨(dú)處理兩株肺腺癌細(xì)胞,48h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。同門(mén)冬酰胺酶單獨(dú)處理組相比,抗氧化劑NAC和門(mén)冬酰胺酶聯(lián)合處理組的肺腺癌細(xì)胞的活力顯著提升。此項(xiàng)結(jié)果表明氧自由基介導(dǎo)了門(mén)冬酰胺酶對(duì)A549和H1975細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。14.抑制自噬能增強(qiáng)門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基的作用。本實(shí)驗(yàn)使用門(mén)冬酰胺酶聯(lián)合自噬抑制劑氯喹處理A549和H1975細(xì)胞,或者門(mén)冬酰胺酶單獨(dú)處理兩株肺腺癌細(xì)胞,48h后Mitosox染色標(biāo)記線粒體氧自由基的產(chǎn)生。同門(mén)冬酰胺酶單獨(dú)處理組相比,氯喹和門(mén)冬酰胺酶聯(lián)合處理組能觀察到信號(hào)更強(qiáng)的紅色熒光,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示抑制自噬能增強(qiáng)門(mén)冬酰胺酶誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基。實(shí)驗(yàn)結(jié)論綜上所述,門(mén)冬酰胺酶對(duì)肺腺癌細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。門(mén)冬酰胺酶能引起肺腺癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬,并且抑制細(xì)胞自噬可顯著提高門(mén)冬酰胺酶對(duì)肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。此外,氧自由基也介導(dǎo)了門(mén)冬酰胺酶對(duì)肺腺癌細(xì)胞的殺傷作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：1230930