本文關(guān)鍵詞：ShRNA沉默ARD1基因?qū)Υ竽c癌SW620細(xì)胞株奧沙利鉑化療敏感性的影響

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【摘要】：目的：本實(shí)驗(yàn)以人大腸癌細(xì)胞SW620細(xì)胞株為研究對(duì)象,采用RNA干擾技術(shù)、RT-PCR法、AnnexinV FITC/PI雙染法、PI單染法等,在細(xì)胞水平上,探討shRNA沉默ARD1基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞奧沙利鉑化學(xué)治療敏感性的影響,從而探討ARD1基因在大腸癌細(xì)胞奧沙利鉑化療過程中作用及其機(jī)制。為大腸癌化學(xué)治療及分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。方法：1.人大腸癌SW620細(xì)胞株、人大腸癌shRNA-NC SW620細(xì)胞株、人大腸癌shRNA-ARD1 SW620細(xì)胞株的復(fù)蘇、培養(yǎng)；2.用RT-PCR檢測(cè)SW620細(xì)胞株、shRNA-NC SW620細(xì)胞株、shRNA-ARD1SW620細(xì)胞株ARD1 mRNA的表達(dá)水平,計(jì)算shRNA-ARD1 SW620穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的沉默率；3.實(shí)驗(yàn)分組：大腸癌SW620細(xì)胞株(空白對(duì)照組)、大腸癌shRNA-NC SW620細(xì)胞株(陰性對(duì)照組)、大腸癌shRNA-ARD1 SW620細(xì)胞株(實(shí)驗(yàn)組)；4.噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)不同濃度奧沙利鉑作用不同時(shí)間后各組細(xì)胞的OD值,并計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率及IC50值；5. RT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同濃度奧沙利鉑處理后各組細(xì)胞ARD1 mRNA的表達(dá)水平；6.流式細(xì)胞術(shù)(PI單染法)檢測(cè)不同濃度奧沙利鉑處理后各組細(xì)胞的周期變化情況；7.流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V FITC/PI染色法)檢測(cè)不同濃度奧沙利鉑處理各組細(xì)胞的總凋亡率及早期凋亡率；8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)；多組均數(shù)的比較用方差分析；資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示；顯著性水準(zhǔn)a=0.05。結(jié)果：1.人大腸癌SW620細(xì)胞、大腸癌shRNA-NC SW620細(xì)胞、大腸癌shRNA-ARD1 SW620細(xì)胞三株細(xì)胞成功培養(yǎng)且生長狀況良好；2.RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞ARD1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量：shRNA-ARD1 SW620細(xì)胞組的ARD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于SW620細(xì)胞組、shRNA-NC SW620細(xì)胞組(P0.05),shRNA-ARD1 SW620培養(yǎng)48h后ARD1 mRNA相對(duì)表達(dá)抑制率達(dá)54.8%：3.MTT檢測(cè)不同濃度(0.2.4、10、 16、32.64ug/ml) L-OHP處理48H后各組細(xì)胞的OD值,計(jì)算抑制率。各組細(xì)胞增殖抑制率隨L-OHP濃度的增高而增高(P0.05),實(shí)驗(yàn)組組抑制率高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P0.05),且實(shí)驗(yàn)組的IC50為(12±0.7) ug/ml低于陰性對(duì)照組的(15.5±0.68) ug/ml及空白對(duì)照組的(15±0.56)ug/ml降低(P0.05),用16ug/ml L-OHP作用于各組SW620細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后MTT檢測(cè)OD值,計(jì)算抑制率,各組SW620細(xì)胞抑制率隨則L-OHP藥物作用時(shí)間延長而增高,L-OHP處理的實(shí)驗(yàn)組抑制率高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P0.05),陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)無意義(P0.05)。運(yùn)用shRNA干擾技術(shù)沉默ARD1表達(dá)能提高人SW620細(xì)胞對(duì)L-OHP的敏感性,細(xì)胞增殖抑制作用明顯加強(qiáng)并存在濃度、時(shí)間依賴性；4. RT-PCR檢測(cè)經(jīng)不同濃度(0、7.5、15.30ug/ml) L-OHP作用后各組細(xì)胞ARD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量：隨著L-OHP的濃度增高ARD1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低(p0.05)。實(shí)驗(yàn)組ARD1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(P0.05),空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組無明顯差異(P0.05)。在細(xì)胞水平上奧沙利鉑作用降低ARD1 mRNA的表達(dá)量,且隨著L-OHP濃度增高各組細(xì)胞ARD1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量越低；5.流式細(xì)胞術(shù)(PI單染法)檢測(cè)在不同濃度L-OHP (0、5、15ug/ml)處理培養(yǎng)48h后各組細(xì)胞周期變化：在低濃度(5ug/ml)處理下各組細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞比例高于無藥物(Oug/ml)作用組(p0.05),實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞增高比例大于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(P0.05),空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組無明顯差異(P0.05)。在高濃度(15ug/ml)的L-OHP作用下出現(xiàn)Sub-G1峰,其Sub-G1期細(xì)胞比例較低濃度奧沙利鉑及無藥物作用組明顯增高(p0.01),其中實(shí)驗(yàn)組Sub-G1期細(xì)胞比例增高程度大于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(P0.05)。shRNA沉默ARD1基因后在低濃度的L-OHP阻滯在G2/M期,在高濃度的L-OHP促進(jìn)SW620細(xì)胞的凋亡；6.流式細(xì)胞術(shù)(AnexinV FITC/PI雙染法)檢測(cè)各組細(xì)胞株SW620細(xì)胞在不同濃度L-OHP (0、5、15ug/ml)處理培養(yǎng)48h后凋亡情況：低濃度L-OHP (5ug/ml)處理的各組細(xì)胞的總凋亡率較無L-OHP (0ug/ml)處理組增高(p0.05),早期凋亡率無明顯差異(p0.05),實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞總凋亡增加較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組有差異(P0.05)。在高濃度L-OHP處理的各組細(xì)胞早期凋亡率及總凋亡率均有明顯的增加(兩者的p0.05),其中實(shí)驗(yàn)組總凋亡率較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組細(xì)胞組增加明顯(P0.01)。shRNA沉默ARD1基因后L-OHP可以促進(jìn)SW620細(xì)胞的凋亡,增加大腸癌SW620細(xì)胞對(duì)L-OHP的化療敏感性；結(jié)論：1.shRNA沉默ARD1基因能提高大腸癌細(xì)胞奧沙利鉑化療的敏感性,抑制大腸癌細(xì)胞增殖；2.奧沙利鉑在細(xì)胞水平上能降低大腸癌細(xì)胞ARD1 mRNA的表達(dá)量；3. shRNA沉默ARD1基因與低濃度奧沙利鉑聯(lián)合作用能促進(jìn)大腸癌細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯于G2/M期；與高濃度奧沙利鉑聯(lián)合作用促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的凋亡；4.shRNA沉默ARD1基因能促進(jìn)奧沙利鉑作用對(duì)大腸癌細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 盧振霞,孫延霞,侯治富,張秀梅;p53和k-ras基因突變?cè)诖竽c癌發(fā)病中的作用[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2002年04期

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本文編號(hào)：1225637