本文關(guān)鍵詞：siRNA特異性沉默TLR4基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞株的增殖和凋亡的影響以及機(jī)制的初步研究

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【摘要】：目的si RNA特異性沉默肝癌細(xì)胞株的TLR4基因,以研究TLR4基因沉默后對人肝癌細(xì)胞株的增殖和凋亡的影響,并初步探討其作用機(jī)制。方法合成TLR4特異性的si RNA 3對(TLR4-si RNA-1、TLR4-si RNA-2、TLR4-si RNA-3),隨機(jī)si RNA陰性對照1對,FAM標(biāo)記的si RNA陰性對照1對;取適量的FAM標(biāo)記的si RNA和lipo2000,使si RNA:lipo2000的比例為0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1轉(zhuǎn)染入Hep G2細(xì)胞,篩選出最佳的轉(zhuǎn)染條件;將合成好的si RNA分別轉(zhuǎn)入人肝癌細(xì)胞株Hep G2,運(yùn)用RT-PCR和Western blot方法篩選出具有最佳沉默效率的si RNA;用具有最佳沉默效率的TLR4 si RNA轉(zhuǎn)染Hep G2,MTT檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡能力的變化;以Western blot法檢測轉(zhuǎn)染前后TLR4下游通路有關(guān)蛋白(My D88、TRIF、IRF3、IκBα、p-IκBα、NF-κB、ERK和JNK)的表達(dá)。結(jié)果用熒光顯微鏡觀察,si RNA:lipo2000比例為1:1時轉(zhuǎn)染效率最高,可達(dá)到(90.48±1.27)%;經(jīng)RT-PCR和Western blot法分析轉(zhuǎn)染前后的TLR4表達(dá)含量,TLR4-si RNA-1和TLR4-si RNA-3均發(fā)揮TLR4基因沉默效應(yīng),TLR4-si RNA 1具有最佳的沉默效率;用具有最佳沉默效率的si RNA-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),將TLR4-si RNA-1轉(zhuǎn)染入Hep G2細(xì)胞,MTT檢測發(fā)現(xiàn)TLR4基因沉默后Hep G2細(xì)胞的增殖能力減低,流式檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加;Western blot檢測發(fā)現(xiàn)TLR4基因沉默后,其下游的蛋白My D88,TRIF,IRF3,IκBα,JNK和ERK表達(dá)量減低,而NF-κB和p-IκBα的表達(dá)量增高。結(jié)論TLR4-si RNA-1沉默TLR4后,很可能通過抑制ERK和JNK途徑和激活NF-κB途徑來抑制人肝癌細(xì)胞株Hep G2的增殖能力和促進(jìn)Hep G2細(xì)胞的凋亡能力。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：1219152