本文關(guān)鍵詞：沉默TRMT61A基因?qū)θ税螂装?637細(xì)胞基因表達(dá)譜和FABP4表達(dá)的影響

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【摘要】：背景和目的膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,近年來在西方國家發(fā)病率呈緩慢下降趨勢(shì),但是近十年在我國的發(fā)病率及死亡率卻呈逐年上升趨勢(shì)。另一方面,膀胱癌需終生監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)情況,膀胱癌的診斷、治療、及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等醫(yī)療費(fèi)用在所用腫瘤中是最高的,給社會(huì)和患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。膀胱鏡檢查和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查是膀胱癌復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)最常用的手段,但是膀胱鏡檢查屬侵入性檢查,且費(fèi)用較高,而尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查雖然特異性較高,但是敏感性較低,因此需要研究新的診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)手段。尿液修飾核苷作為非常有潛力的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于多種腫瘤的診斷、病情檢測(cè)及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),1-甲基腺苷(m1A)和1-甲基次黃苷(1-mel)聯(lián)合檢測(cè)膀胱癌具有很高的靈敏度(92.45%)和特異性(87.50%)。因此,尿液修飾核苷可能成為有潛力的膀胱癌診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物。m1A由m1A58甲基轉(zhuǎn)移酶(hTrm6P/hTrm61P)催化t RNA58位的腺苷(A)生成,其中hTrm61p由TRMT61A基因編碼,是其中的催化亞基。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TRMT61A、hTrm61p在膀胱癌組織中高表達(dá)。應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)在人膀胱癌細(xì)胞系T24、5637、EJ中篩選出TRMT61A高表達(dá)細(xì)胞株5637,在5637細(xì)胞中應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默TRMT61A后,細(xì)胞增殖減慢、凋亡增多、侵襲性減弱。說明TRMT61A在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)在5637細(xì)胞中沉默TRMT61A對(duì)基因表達(dá)譜的影響,并應(yīng)用panther數(shù)據(jù)庫對(duì)其中的差異基因進(jìn)行Go Term分析,研究TRMT61A在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中可能的信號(hào)通路�；蛐酒胁町惐稊�(shù)超過5的有四個(gè)基因,其中FABP4在沉默TRMT61A后表達(dá)明顯升高。大量研究表明,FABP4在膀胱癌組織中低表達(dá),且與病理分級(jí)、分期及預(yù)后較差明確相關(guān),因此應(yīng)用RT qPCR技術(shù)驗(yàn)證在5637細(xì)胞中沉默TRMT61A基因?qū)ABP4表達(dá)的影響。方法1基因芯片共分兩組:Lip2000(lipofectamineR2000處理的5637細(xì)胞),siRNA組(lipofectamineR2000轉(zhuǎn)染TRMT61A-siRNA的5637細(xì)胞)。在5637細(xì)胞中,siRNA技術(shù)沉默TRMT61A,RT qPCR技術(shù)檢測(cè)沉默效率,當(dāng)沉默效率至約70%時(shí),送檢基因芯片,檢測(cè)基因表達(dá)譜的改變。利用panther數(shù)據(jù)庫,對(duì)差異基因進(jìn)行Go Term分析。2 RT qPCR技術(shù)驗(yàn)證5637細(xì)胞中沉默TRMT61A對(duì)FABP4 mRNA表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)共分四組:blank組(未做任何處理的5637細(xì)胞),Lip2000(lipofectamineR2000處理的5637細(xì)胞),NC組(lipofectamineR2000轉(zhuǎn)染negative control-siRNA的5637細(xì)胞),siRNA組(lipofectamineR2000轉(zhuǎn)染TRMT61A-siRNA的5637細(xì)胞)。3 TRMT61A、FABP4在膀胱癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科2014年1月至2016年1月經(jīng)病理證實(shí)為膀胱癌的30例,RT qPCR技術(shù)檢測(cè)TRMT61A與FABP4 mRNA在癌組織和癌旁組織的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果1基因芯片結(jié)果將基因的探針信號(hào)與背景信號(hào)有顯著差異,且標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)值8作為篩選閾值,確定有效表達(dá)的基因數(shù)目。差異倍數(shù)(FC),以FC2或FC0.5為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。FC2,即沉默TRMT61A基因后明顯上調(diào)表達(dá)的基因,共99個(gè);FC0.5,即沉默TRMT61A基因后明顯下調(diào)表達(dá)的基因,共107個(gè)。其中FC5或FC0.2基因共有4個(gè):STC2、FABP4、KRT13、ERMP1。Go Term分析結(jié)果表明:差異基因發(fā)揮多種分子功能、參與多種生物過程、構(gòu)成多種細(xì)胞組分、影響多種信號(hào)通路,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生廣泛影響。2RT qPCR技術(shù)驗(yàn)證5637細(xì)胞中沉默TRMT61A對(duì)FABP4 mRNA表達(dá)的影響與NC組(0.999±0.041)相比,siRNA組(0.563±0.050)TRMT61A mRNA表達(dá)顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),TRMT61A的沉默效率為43.7%。與NC組(1.000±0.019)相比,siRNA組(2.260±1.167)FABP4mRNA表達(dá)顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3TRMT61A、FABP4 mRNA在30例膀胱癌組織樣本的相對(duì)表達(dá)水平30例膀胱癌組織樣本TRMT61A mRNA在癌組織中表達(dá)明顯升高,與癌旁組織相比(1.000±0.000),在癌組織的表達(dá)水平為2.076±1.349,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。28例膀胱癌組織樣本,FABP4 mRNA在癌旁組織的表達(dá)明顯降低,與癌旁組織(1.000±0.000),在癌組織的表達(dá)水平為0.568±1.420,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1在5637細(xì)胞中siRNA沉默TRMT61A能顯著改變基因表達(dá)譜25637細(xì)胞中siRNA沉默TRMT61A可以明顯上調(diào)FABP4 mRNA的表達(dá)。說明下調(diào)TRMT61A發(fā)揮抗癌作用是通過上調(diào)FABP4的表達(dá)發(fā)揮作用的。因此,抑制TRMT61A的表達(dá)可能成為抗膀胱腫瘤藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.14

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