本文關(guān)鍵詞：沉默TRMT61A基因?qū)θ税螂装?637細胞基因表達譜和FABP4表達的影響

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【摘要】：背景和目的膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,近年來在西方國家發(fā)病率呈緩慢下降趨勢,但是近十年在我國的發(fā)病率及死亡率卻呈逐年上升趨勢。另一方面,膀胱癌需終生監(jiān)測復發(fā)情況,膀胱癌的診斷、治療、及復發(fā)監(jiān)測等醫(yī)療費用在所用腫瘤中是最高的,給社會和患者帶來沉重的經(jīng)濟負擔。膀胱鏡檢查和尿脫落細胞學檢查是膀胱癌復發(fā)監(jiān)測最常用的手段,但是膀胱鏡檢查屬侵入性檢查,且費用較高,而尿脫落細胞學檢查雖然特異性較高,但是敏感性較低,因此需要研究新的診斷和復發(fā)監(jiān)測手段。尿液修飾核苷作為非常有潛力的腫瘤標志物對于多種腫瘤的診斷、病情檢測及預后評估具有重要意義。我們前期實驗發(fā)現(xiàn),1-甲基腺苷(m1A)和1-甲基次黃苷(1-mel)聯(lián)合檢測膀胱癌具有很高的靈敏度(92.45%)和特異性(87.50%)。因此,尿液修飾核苷可能成為有潛力的膀胱癌診斷和復發(fā)監(jiān)測的標志物。m1A由m1A58甲基轉(zhuǎn)移酶(hTrm6P/hTrm61P)催化t RNA58位的腺苷(A)生成,其中hTrm61p由TRMT61A基因編碼,是其中的催化亞基。在后續(xù)實驗中發(fā)現(xiàn)TRMT61A、hTrm61p在膀胱癌組織中高表達。應用RT-qPCR技術(shù)在人膀胱癌細胞系T24、5637、EJ中篩選出TRMT61A高表達細胞株5637,在5637細胞中應用siRNA技術(shù)沉默TRMT61A后,細胞增殖減慢、凋亡增多、侵襲性減弱。說明TRMT61A在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究在前期工作的基礎上,應用基因芯片技術(shù)檢測在5637細胞中沉默TRMT61A對基因表達譜的影響,并應用panther數(shù)據(jù)庫對其中的差異基因進行Go Term分析,研究TRMT61A在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中可能的信號通路�；蛐酒胁町惐稊�(shù)超過5的有四個基因,其中FABP4在沉默TRMT61A后表達明顯升高。大量研究表明,FABP4在膀胱癌組織中低表達,且與病理分級、分期及預后較差明確相關(guān),因此應用RT qPCR技術(shù)驗證在5637細胞中沉默TRMT61A基因?qū)ABP4表達的影響。方法1基因芯片共分兩組:Lip2000(lipofectamineR2000處理的5637細胞),siRNA組(lipofectamineR2000轉(zhuǎn)染TRMT61A-siRNA的5637細胞)。在5637細胞中,siRNA技術(shù)沉默TRMT61A,RT qPCR技術(shù)檢測沉默效率,當沉默效率至約70%時,送檢基因芯片,檢測基因表達譜的改變。利用panther數(shù)據(jù)庫,對差異基因進行Go Term分析。2 RT qPCR技術(shù)驗證5637細胞中沉默TRMT61A對FABP4 mRNA表達的影響實驗共分四組:blank組(未做任何處理的5637細胞),Lip2000(lipofectamineR2000處理的5637細胞),NC組(lipofectamineR2000轉(zhuǎn)染negative control-siRNA的5637細胞),siRNA組(lipofectamineR2000轉(zhuǎn)染TRMT61A-siRNA的5637細胞)。3 TRMT61A、FABP4在膀胱癌組織中的相對表達水平選取鄭州大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科2014年1月至2016年1月經(jīng)病理證實為膀胱癌的30例,RT qPCR技術(shù)檢測TRMT61A與FABP4 mRNA在癌組織和癌旁組織的相對表達水平。結(jié)果1基因芯片結(jié)果將基因的探針信號與背景信號有顯著差異,且標準化信號值8作為篩選閾值,確定有效表達的基因數(shù)目。差異倍數(shù)(FC),以FC2或FC0.5為顯著性差異標準。FC2,即沉默TRMT61A基因后明顯上調(diào)表達的基因,共99個;FC0.5,即沉默TRMT61A基因后明顯下調(diào)表達的基因,共107個。其中FC5或FC0.2基因共有4個:STC2、FABP4、KRT13、ERMP1。Go Term分析結(jié)果表明:差異基因發(fā)揮多種分子功能、參與多種生物過程、構(gòu)成多種細胞組分、影響多種信號通路,對細胞產(chǎn)生廣泛影響。2RT qPCR技術(shù)驗證5637細胞中沉默TRMT61A對FABP4 mRNA表達的影響與NC組(0.999±0.041)相比,siRNA組(0.563±0.050)TRMT61A mRNA表達顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),TRMT61A的沉默效率為43.7%。與NC組(1.000±0.019)相比,siRNA組(2.260±1.167)FABP4mRNA表達顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3TRMT61A、FABP4 mRNA在30例膀胱癌組織樣本的相對表達水平30例膀胱癌組織樣本TRMT61A mRNA在癌組織中表達明顯升高,與癌旁組織相比(1.000±0.000),在癌組織的表達水平為2.076±1.349,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。28例膀胱癌組織樣本,FABP4 mRNA在癌旁組織的表達明顯降低,與癌旁組織(1.000±0.000),在癌組織的表達水平為0.568±1.420,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論1在5637細胞中siRNA沉默TRMT61A能顯著改變基因表達譜25637細胞中siRNA沉默TRMT61A可以明顯上調(diào)FABP4 mRNA的表達。說明下調(diào)TRMT61A發(fā)揮抗癌作用是通過上調(diào)FABP4的表達發(fā)揮作用的。因此,抑制TRMT61A的表達可能成為抗膀胱腫瘤藥物研發(fā)的潛在靶點。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.14

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