本文關(guān)鍵詞：mTORC1相關(guān)蛋白在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達(dá)及意義

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【摘要】：神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine tumor,NET)是一組起源于彌散神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的異質(zhì)性腫瘤,可發(fā)生于全身多個(gè)部位,其中胃腸胰NETs(GEP-NET)約占65%~75%。多個(gè)國(guó)家以及地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示GEP-NET的發(fā)病率呈穩(wěn)定上升態(tài)勢(shì),其患病率在所有消化道惡性腫瘤中僅次于結(jié)直腸癌而居于第二位。本病癥狀復(fù)雜多樣,可由良性逐漸發(fā)展成惡性,病程緩慢,而且易與內(nèi)分泌等相關(guān)疾病相混淆,加上缺乏準(zhǔn)確有效的檢查手段,誤診和漏診常見。目前對(duì)于GEP-NET,手術(shù)切除是最主要的治療方法,藥物治療可應(yīng)用細(xì)胞毒性藥物、生長(zhǎng)抑素類似物等緩解癥狀,抗血管生成及抗生長(zhǎng)因子的靶向治療是新的治療方法。m TOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、自噬以及細(xì)胞周期等多個(gè)方面。目前用于治療的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mammalian target of rapamycin complex 1,m TORC1)特異性抑制劑依維莫司可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)出顯著的臨床療效。但實(shí)際上GEP-NET患者對(duì)依維莫司治療的反應(yīng)不一,其機(jī)制尚未完全闡明。惡性腫瘤的快速生長(zhǎng)需要充足的營(yíng)養(yǎng)和能量,其供給方式主要包括糖酵解、谷氨酰胺依賴的合成代謝和脂肪代謝等。惡性腫瘤的一個(gè)重要特征就是細(xì)胞的能量代謝異常,腫瘤在其發(fā)生發(fā)展過程中常伴隨著代謝途徑的重塑。臨床上我們發(fā)現(xiàn)近50%的胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤PET-CT檢查表現(xiàn)為陰性,同時(shí)分級(jí)越高,PET-CT檢查陽性率越高。提示我們部分GEP-NET存在代謝方式的多樣性而并非以糖酵解為主。近年來相關(guān)研究表明mTORC1的激活與營(yíng)養(yǎng)、能量信號(hào)等有關(guān),但和谷氨酰胺代謝鮮見報(bào)道。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織標(biāo)本中高表達(dá)谷氨酰胺酶1型(GLS1)和m TORC1相關(guān)蛋白R(shí)aptor,體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞株BON-1的生長(zhǎng)明顯依賴于谷氨酰胺代謝,mTORC1抑制劑可以影響GLS1的表達(dá)從而影響谷氨酰胺代謝進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。本研究初步探討了mTORC1信號(hào)通路參與的細(xì)胞能量代謝,為胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的治療提供新方向。實(shí)驗(yàn)方法第一部分(1)westernblot檢測(cè)人胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞株bon-1中代謝相關(guān)酶表達(dá)水平;(2)選取胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤臨床組織標(biāo)本,利用免疫組化檢測(cè)糖酵解和谷氨酰胺代謝關(guān)鍵酶ldha、pkm2、slc1a5、gs、got2、gls1、gls2的表達(dá),同時(shí)檢測(cè)不同分級(jí)的組織標(biāo)本中mtorc1及mtorc2通路中相關(guān)蛋白raptor、rictor的表達(dá)情況。第二部分(1)體外培養(yǎng)人胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞株bon-1,分別剝奪葡萄糖和谷氨酰胺,cck-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡;(2)干擾bon-1細(xì)胞gls1表達(dá),檢測(cè)細(xì)胞增殖及克隆生長(zhǎng)情況;(3)在剝奪谷氨酰胺的培養(yǎng)基中加入谷氨酸(glu)后檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況;(4)mtorc1抑制劑處理bon-1細(xì)胞,用westernblot檢測(cè)gls1蛋白表達(dá)水平及胞內(nèi)谷氨酰胺水平,采用cck-8檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果:1、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織標(biāo)本和細(xì)胞系中代謝相關(guān)酶的表達(dá)情況(1)westernblot檢測(cè)人胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞株bon-1中代謝相關(guān)酶表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺代謝相關(guān)酶gls呈高表達(dá);(2)在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織標(biāo)本中,免疫組化結(jié)果顯示谷氨酰胺相關(guān)代謝酶gls1相對(duì)于癌旁組織為高表達(dá);(3)gls1的表達(dá)情況和ki67分級(jí)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì);(4)在約90%(27/30)的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織標(biāo)本中,免疫組化結(jié)果提示腫瘤組織中raptor相對(duì)于癌旁組織表達(dá)呈強(qiáng)陽性;(5)rictor在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織標(biāo)本中呈陰性或弱陽性表達(dá),在各分級(jí)中表達(dá)無明顯差異。2、mtorc1通路調(diào)節(jié)gls1介導(dǎo)的谷氨酰胺代謝(1)體外培養(yǎng)人胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞株bon-1,分別剝奪葡萄糖和谷氨酰胺發(fā)現(xiàn)剝奪谷氨酰胺后細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯減慢,細(xì)胞生長(zhǎng)周期明顯受到阻滯,凋亡增加;(2)干擾bon-1細(xì)胞中g(shù)ls1表達(dá),細(xì)胞增殖和克隆生長(zhǎng)能力下降;(3)在剝奪谷氨酰胺的培養(yǎng)基中加入谷氨酰胺的代謝產(chǎn)物谷氨酸后可以回復(fù)細(xì)實(shí)驗(yàn)方法:胞生長(zhǎng);(4)mTORC1特異性抑制劑處理BON-1細(xì)胞后,Western Blot檢測(cè)GLS1蛋白表達(dá)水平下降,胞內(nèi)谷氨酰胺水平升高,同時(shí)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)論:mTORC1信號(hào)通路在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中常常是激活的,人胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞株BON-1明顯依賴于谷氨酰胺生長(zhǎng),m TORC1特異性抑制劑通過影響谷氨酰胺分解代謝關(guān)鍵酶GLS1的表達(dá)從而影響谷氨酰胺代謝,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735

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本文編號(hào)：1216941