本文關(guān)鍵詞：shRNA干擾MACC1表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲力的影響及其相關(guān)上游信號(hào)通路研究

  更多相關(guān)文章： MACC1基因 RNA干擾 侵襲 轉(zhuǎn)移 信號(hào)通路

【摘要】：目的:探討RNA干擾抑制MACC1基因表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞遷移、侵襲的調(diào)控作用,初步探討調(diào)控過(guò)程中可能涉及的上游信號(hào)通路。方法:(1)根據(jù)MACC1基因(7p21.1)核苷酸序列(NM_182762.3)設(shè)計(jì)并構(gòu)建3個(gè)含不同RNA干擾片段的MACC1-sh RNA#1~3重組質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo),轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株中,經(jīng)嘌呤霉素篩選,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞株,同法獲得陰性對(duì)照組細(xì)胞。(2)將獲得的細(xì)胞株采用q PCR、Western Blot進(jìn)行干擾效能檢測(cè)并篩選出干擾效果最佳的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞株。(3)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組(MACC1-RNAi#2/SW620細(xì)胞株)、陰性對(duì)照組(MACC1-control/SW620細(xì)胞株)和空白對(duì)照組(未處理的SW620細(xì)胞株),采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察RNA干擾后細(xì)胞的遷移、侵襲能力的變化。(4)應(yīng)用蛋白激酶特異性抑制劑PD98059、Curcumin、Wortmannin、Dasatinib處理以上實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組三組SW620細(xì)胞株,阻斷可能影響結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲力的分子通路:Ras/Raf/MAPK、Wnt/β-Catenin/GSK-3β、PI3K/ILK/PKB、Src/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,通過(guò)q PCR檢測(cè)上述三組SW620細(xì)胞中MACC1基因m RNA表達(dá),篩選出MACC1基因在結(jié)腸癌SW620細(xì)胞遷移、侵襲力調(diào)控中所涉及的可能上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。結(jié)果:成功獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞,通過(guò)嘌呤霉素篩選的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)80%以上。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞株干擾效能檢測(cè)結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞株的MACC1基因m RNA及蛋白的表達(dá)降低,(P0.05)。干擾組之兩兩比較顯示:MACC1-RNAi#2/SW620細(xì)胞株干擾效果最明顯(P0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與對(duì)照組對(duì)比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(MACC1-RNAi#2/SW620細(xì)胞株)的遷移能力降低,(P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(MACC1-RNAi#2/SW620細(xì)胞株)的侵襲能力受到了顯著抑制,(P0.05)。激酶特異性抑制劑處理的細(xì)胞q PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:抑制劑抑制Ras/Raf/MAPK、Wnt/β-Catenin/GSK-3β及Src/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后,SW620細(xì)胞株中MACC1基因m RNA表達(dá)下降,(P0.05)。抑制PI3K/ILK/PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則對(duì)MACC1基因m RNA表達(dá)未見(jiàn)明顯影響。結(jié)論:MACC1基因具有調(diào)控結(jié)腸癌SW620細(xì)胞遷移、侵襲能力的作用,并可能成為結(jié)腸癌分子治療的潛在靶標(biāo)。Ras/Raf/MAPK、Wnt/β-Catenin/GSK-3β和Src/STAT3通道可能參與了MACC1基因表達(dá)的上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.35

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本文編號(hào)：1204665