本文關(guān)鍵詞：胃癌多藥耐藥相關(guān)分泌型糖蛋白的篩選與驗(yàn)證

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【摘要】：背景在中國,胃癌是第二大常見腫瘤同時(shí)也是第二大致死性腫瘤。盡管人們對胃癌多藥耐藥(Multi-drug resistance,MDR)的研究已取得了諸多進(jìn)展,多藥耐藥的產(chǎn)生仍是胃癌患者化療失敗的主要原因。腫瘤多藥耐藥的發(fā)生是一個(gè)多分子、多信號通路參與的復(fù)雜的生物學(xué)進(jìn)程,然而既往的研究大都關(guān)注于特定蛋白尤其是細(xì)胞內(nèi)蛋白的分子表達(dá)對腫瘤多藥耐藥的作用,較少涉及蛋白翻譯后修飾的研究。糖基化修飾是一種非常重要且常見的蛋白翻譯后修飾,其對蛋白的正確折疊、構(gòu)象形成乃至功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。人們發(fā)現(xiàn),蛋白的糖基化修飾極大地影響了腫瘤的形成、增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)進(jìn)程。此外,蛋白的糖基化修飾也影響著腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。研究發(fā)現(xiàn),特定蛋白的糖基化修飾對腫瘤多藥耐藥的產(chǎn)生有著重要的意義,同時(shí),腫瘤細(xì)胞特定糖型的變化也可能影響化療藥物對腫瘤的療效。近年來,隨著人們對腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中重要作用的認(rèn)識的不斷深入,腫瘤細(xì)胞分泌型糖蛋白在腫瘤多藥耐藥過程中的關(guān)鍵作用也逐漸得到了廣泛認(rèn)可。關(guān)于分泌型糖蛋白參與胃癌多藥耐藥的研究已有諸多報(bào)道,但我們對分泌型糖蛋白的糖基化修飾尤其是位點(diǎn)特異性糖基化修飾在胃癌多藥耐藥中的作用仍不十分清楚。本項(xiàng)研究在我們以往對腫瘤細(xì)胞蛋白糖基化修飾工作的基礎(chǔ)上,建立了完整的胃癌細(xì)胞分泌型糖蛋白位點(diǎn)特異性糖基化修飾的定性和定量分析方法,并篩選得到了一批和胃癌多藥耐藥產(chǎn)生密切相關(guān)的異常糖基化修飾的分泌型糖蛋白,為全面闡明胃癌多藥耐藥的發(fā)生機(jī)制提供了新思路。目的1.建立對胃癌細(xì)胞分泌型糖蛋白位點(diǎn)特異性糖型的定性和定量分析方法;2.通過高通量質(zhì)譜分析,研究胃癌細(xì)胞分泌型糖蛋白的糖基化修飾在胃癌多藥耐藥過程中的變化;3.從糖基化修飾的角度,獲得在胃癌多藥耐藥中具有潛在意義的分泌型糖蛋白,為以后的工作奠定基礎(chǔ)。方法1.通過對胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清的超濾離心,得到高度濃縮的細(xì)胞分泌蛋白,隨后用胰蛋白酶進(jìn)行酶解;之后,通過親水作用液相色譜實(shí)現(xiàn)對糖肽的高效富集;2.通過高通量質(zhì)譜技術(shù),獲取完整糖肽以及切除糖鏈后肽段的質(zhì)譜數(shù)據(jù);3.通過自編軟件Ar Mone從原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)中提取出位點(diǎn)特異性糖型數(shù)據(jù),之后用Perseus軟件對糖基化數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析;4.通過Western blot實(shí)驗(yàn)和TCGA數(shù)據(jù)驗(yàn)證AXL與胃癌多藥耐藥之間的關(guān)系。結(jié)果1.胃癌細(xì)胞系分泌蛋白組數(shù)據(jù)集總的來講,我們從三株胃癌細(xì)胞系(SGC7901,SGC7901/ADR和SGC7901/VCR)中共鑒定到了1033個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)(localization probability0.75),這些糖基化位點(diǎn)對應(yīng)于436個(gè)非冗余的N-糖基化蛋白。此外,我們共鑒定出了2222個(gè)高可信的N-連接位點(diǎn)特異性糖型。之后,我們綜合運(yùn)用生物信息學(xué)軟件和Uniprot數(shù)據(jù)庫來確定所鑒定到的蛋白是否為分泌型糖蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn):272個(gè)糖蛋白為經(jīng)典的分泌型糖蛋白,74個(gè)蛋白可經(jīng)非經(jīng)典的分泌途徑分泌至胞外。這一結(jié)果從側(cè)面證明了我們的分泌蛋白糖基化分析方法的高效性。2.胃癌多藥耐藥過程中N-糖基化位點(diǎn)占有率的變化與SGC7901相比,共有240個(gè)N-糖基化位點(diǎn)在SGC7901-ADR/VCR中發(fā)生了顯著的改變(124個(gè)糖基化位點(diǎn)的占有率升高,116個(gè)糖基化位點(diǎn)的占有率降低)。此外,這些顯著變化的糖基化位點(diǎn)主要對應(yīng)于163個(gè)糖基化蛋白,表達(dá)上調(diào)的糖基化位點(diǎn)對應(yīng)于84個(gè)糖蛋白,表達(dá)下調(diào)的糖基化位點(diǎn)對應(yīng)于76個(gè)糖蛋白,3個(gè)糖蛋白同時(shí)包含上調(diào)的糖基化位點(diǎn)和下調(diào)的糖基化位點(diǎn)。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析表明:上調(diào)的糖基化位點(diǎn)所對應(yīng)的87個(gè)糖蛋白主要發(fā)揮結(jié)合活性(32.4%),受體活性(25.4%)和催化活性(23.9%);而下調(diào)的糖基化位點(diǎn)所對應(yīng)的79個(gè)糖蛋白所具有的分子功能主要為催化活性(33.3%),受體活性(25.0%)和結(jié)合活性(25.0%)。3.胃癌多藥耐藥過程中位點(diǎn)特異性糖型的變化我們發(fā)現(xiàn)只有核心巖藻糖以及復(fù)合型多糖在胃癌細(xì)胞產(chǎn)生獲得性耐藥以后發(fā)生了顯著的變化,而其他幾種重要的糖型并沒有表現(xiàn)出明顯的改變。此外,我們進(jìn)一步確定了SGC7901和胃癌耐藥細(xì)胞系之間明顯差異的位點(diǎn)特異性糖型。共有175個(gè)位點(diǎn)特異性糖型在胃癌耐藥細(xì)胞的分泌蛋白中顯著上升,而324個(gè)位點(diǎn)特異性糖型在胃癌多藥耐藥細(xì)胞的分泌蛋白中顯著下調(diào)。有意思的是,我們發(fā)現(xiàn)一些糖基化位點(diǎn)既連接有表達(dá)上調(diào)的糖型也連接有表達(dá)下降的糖型,這充分說明了糖基化修飾的高度復(fù)雜性。總的來講,106個(gè)糖蛋白中151個(gè)糖基化位點(diǎn)上的499個(gè)位點(diǎn)特異性糖型在胃癌多藥耐藥細(xì)胞和其親本細(xì)胞中差異顯著。4.胃癌多藥耐藥過程中顯著差異的糖基化位點(diǎn)和位點(diǎn)特異性糖型的綜合分析我們發(fā)現(xiàn)顯著差異的位點(diǎn)特異性糖型所對應(yīng)的糖基化位點(diǎn)與位點(diǎn)水平上顯著變化的糖基化位點(diǎn)很少發(fā)生重合。此外,我們發(fā)現(xiàn)特定位點(diǎn)上所連接的差異表達(dá)的糖型不少于2個(gè)的糖蛋白共有57個(gè),而這些糖蛋白中有33個(gè)已被報(bào)道和腫瘤的多藥耐藥相關(guān)。這一結(jié)果也從側(cè)面證明了蛋白糖基化修飾和腫瘤多藥耐藥密切相關(guān)。5.AXL在胃癌多藥耐藥中作用的初步驗(yàn)證我們發(fā)現(xiàn)AXL m RNA的表達(dá)在胃癌多藥耐藥細(xì)胞中顯著上升,此外,分泌型AXL在胃癌多藥耐藥細(xì)胞培養(yǎng)上清中的表達(dá)也有著明顯的升高。更重要的是,基于TCGA數(shù)據(jù)庫中的295例胃癌數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)胃癌組織中AXL m RNA的高表達(dá)預(yù)示著胃癌患者的預(yù)后不良。綜上所述,我們首次證明了AXL在胃癌多藥耐藥過程中其糖基化修飾和蛋白表達(dá)都發(fā)生了顯著的改變,提示分泌型AXL在胃癌多藥耐藥的產(chǎn)生中發(fā)揮著重要的作用。結(jié)論我們率先從組學(xué)層面系統(tǒng)地研究了胃癌細(xì)胞分泌型糖蛋白的位點(diǎn)特異性糖基化修飾,證明了胃癌細(xì)胞分泌型糖蛋白的糖基化位點(diǎn)以及位點(diǎn)特異性糖型在細(xì)胞產(chǎn)生獲得性多藥耐藥后發(fā)生了顯著改變。此外,進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)某些糖基化修飾異常的分泌型糖蛋白可能在胃癌多藥耐藥的進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用,這一結(jié)果表明對特定糖蛋白糖基化修飾的調(diào)節(jié)可能成為逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥的潛在治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
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本文編號：1204891