發(fā)布時(shí)間：2017-11-19 11:19

  本文關(guān)鍵詞：SP1介導(dǎo)的miR-520d-5p通過(guò)靶向Cthrc1抑制結(jié)直腸癌的增值和轉(zhuǎn)移

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【摘要】：研究背景和目的：美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)提供的數(shù)據(jù)顯示：結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率仍然位居第三。在我國(guó),結(jié)直腸癌是第4位最常見(jiàn)的惡性腫瘤,特別是隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們生活水平的提高,飲食結(jié)構(gòu)的改變,結(jié)直腸癌的發(fā)病率仍然有提高的趨勢(shì)。盡管結(jié)直腸癌的總預(yù)后相對(duì)較好,但是晚期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍舊是結(jié)直腸癌死亡的主要原因。因此,如果能充分應(yīng)用腫瘤分子生物學(xué)的研究成果,篩選出一些新穎的分子標(biāo)記用于結(jié)直腸癌的早期篩查,這對(duì)于提高結(jié)直腸癌的早期診斷陽(yáng)性率和改善預(yù)后結(jié)局具有非常重要的臨床意義。MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為19-22bp左右大小的小分子RNA,它們能通過(guò)與靶基因mRNA 3'UTR堿基特異結(jié)合從而形成miRISC(miRNA-associated, multiprotein RNA induced-silencing complex)的方式將其mRNA徹底降解或者抑制其翻譯過(guò)程,從而抑制靶基因的表達(dá)。隨著研究的逐步深入,越來(lái)越多的證據(jù)表明,miRNA在多種腫瘤組織中有異常表達(dá),其廣泛參與細(xì)胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)移及能量代謝過(guò)程。同時(shí),如普通基因一樣,成熟miRNA也是pre-miRNA由Dicer酶剪切成熟的。Pre-miRNA由基因相應(yīng)序列轉(zhuǎn)錄而成,此過(guò)程需要轉(zhuǎn)錄因子的參與。特別的,隨著血液標(biāo)本檢測(cè)miRNA技術(shù)的提高,通過(guò)對(duì)血液中特異miRNA的檢測(cè),可以用于腫瘤的臨床診斷、預(yù)后評(píng)估、術(shù)后監(jiān)測(cè)及隨訪!文獻(xiàn)報(bào)道：miR-520d-5p通過(guò)靶向TWIST1抑制乳腺癌的增殖和遷移。另外,miR-520d-3p可以通過(guò)靶向EphA2抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移、轉(zhuǎn)移。但是,截止目前,尚未有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)i520家族如何在結(jié)直腸癌中起作用的研究。因此,我們檢測(cè)了miR-520d在結(jié)直腸癌中的相應(yīng)表達(dá)及其在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。我們通過(guò)基因芯片篩查和Western Blot的方式證實(shí)了CTHRC1在結(jié)直腸癌中異常高表達(dá),并結(jié)合臨床病理學(xué)資料和生存分析,證實(shí)了CTHRC1是結(jié)直腸癌預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。已有報(bào)道證實(shí)CTHRC1通過(guò)選擇性激活非經(jīng)典Wnt通路促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移。在癌組織中,CTHRC1可以通過(guò)誘導(dǎo)ERK1/2的磷酸化而增強(qiáng)MMP9的表達(dá)而促進(jìn)EMT的發(fā)生。通過(guò)在相應(yīng)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索,我們發(fā)現(xiàn)Cthrc1是miR-520d-5p潛在的靶基因。SP1 (Transcription Factor Speciality Protein 1)通過(guò)與相應(yīng)基因上游啟動(dòng)子序列特異性結(jié)合,從而激活或者抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。SP1廣泛參與多種腫瘤的演進(jìn)過(guò)程。Yang WB等證實(shí)了SP1通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活miR-182調(diào)控肺癌的演進(jìn)。因此,我們推測(cè)miR-520d通過(guò)抑制CTHRC1的表達(dá)調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。同時(shí),其接受SPl的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本研究旨在證實(shí)SP1/miR-520d/ CTHRC1的信號(hào)機(jī)制,并為探討結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法1.miR-520d-5p在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法檢測(cè)了42對(duì)結(jié)直腸癌患者及其配對(duì)正常腸粘膜上皮中miR-520d-5p的表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)了SW480、SW620、HT29、LS174T、 LoVo、HCT116、DLD-17株結(jié)直腸癌細(xì)胞株中miR-520d-5p的表達(dá)。2.miR-520d-5p靶基因的篩選和鑒定(1)利用生物信息學(xué)相關(guān)網(wǎng)站TargetScan、microRNA.org和miRWalk預(yù)測(cè)miR-520d-5p的靶基因,篩選其候選靶基因。(2)熒光定量RT-PCR檢測(cè)CTHRC1 mRNA在52對(duì)結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的相應(yīng)表達(dá)水平。Western Blot檢測(cè)CTHRC1在組織和細(xì)胞中的表達(dá)。(3)擴(kuò)增包括miR-520d-5p結(jié)合位點(diǎn)的Cthrc1 3'UTR基因片段,并與pmirGLO雙熒光素酶載體連接,同時(shí)將Cthrc1 3'UTR片段上的miR-520d-5p結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。應(yīng)用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-520d-5p與Cthrc1 3'UTR的結(jié)合情況,明確Cthrcl是否為niR-520d-5p直接作用的靶基因。3.miR-520d-5p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)行為的影響(1)利用慢病毒包裝系統(tǒng),制備穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-520d-5p的病毒上清,并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入LoVo細(xì)胞中,建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-520d-5p的細(xì)胞株。并進(jìn)行體外細(xì)胞增殖、平板克隆、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。(2)將miR-520d-5p的化學(xué)合成模擬類似物(mimic)和抑制物(inhibitor)分別轉(zhuǎn)入SW480、SW620、LoVo、HCT116四株結(jié)直腸癌細(xì)胞中,應(yīng)用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-520d-5p過(guò)表達(dá)和抑制時(shí),其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞體外的增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力的影響。(3)應(yīng)用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-520d-5p過(guò)表達(dá)對(duì)體內(nèi)結(jié)直腸癌細(xì)胞成瘤能力的影響。4.SP1轉(zhuǎn)錄激活miR-520d-5p的證實(shí)(1)應(yīng)用UCS、Ensemble、TFSEARCH、Mapper2.0、Promoter 2.0 Prediction Server等生物信息學(xué)網(wǎng)站查找miR-520d-5p啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)合位點(diǎn)。(2)熒光定量RT-PCR檢測(cè)20對(duì)結(jié)直腸癌組織中SP1的相應(yīng)表達(dá),并將其與之對(duì)應(yīng)的miR-520d-5p的相對(duì)表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析。(3)應(yīng)用靶向針對(duì)SP1的siRNA,將其轉(zhuǎn)染進(jìn)LoVo和SW620細(xì)胞中,以qRT-PCR檢測(cè)當(dāng)SP1被敲低后miR-520d-5p的相對(duì)表達(dá)。(4)擴(kuò)增包含SP1結(jié)合位點(diǎn)的niR-520d-5p啟動(dòng)子序列并將其克隆進(jìn)pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告載體,同時(shí)對(duì)相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行單獨(dú)突變得到相應(yīng)的突變載體。先將SP1siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T和LoVo細(xì)胞里,24h后再將miR-520d-5p啟動(dòng)子載體轉(zhuǎn)染入HEK293T和LoVo細(xì)胞。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子SP1對(duì)miR-520d-5p舌性的影響。5.miR-520d-5p對(duì)結(jié)直腸癌EMT的影響及相應(yīng)信號(hào)的探討將miR-520d-5p的化學(xué)合成模擬類似物(mimic)和抑制物(inhibitor)分別轉(zhuǎn)入SW480、SW620、LoVo、HCT116四株結(jié)直腸癌細(xì)胞中,應(yīng)用Western Blot檢測(cè)四株細(xì)胞EMT標(biāo)記和ERK1/2、p-ERK1/2蛋白質(zhì)的變化。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量的數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation,SD)表示。組織的熒光定量PCR結(jié)果ACt的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)(Paired-Sample t text),癌組織中miR-520d-5p的表達(dá)與病人臨床資料的分析用Fisher's確切檢驗(yàn),細(xì)胞熒光定量PCR結(jié)果2-△△Ct值、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Samples t test)。組織和細(xì)胞中miR-520d-5p和Cthrc1及SP1與miR-520d-5p表達(dá)量的相關(guān)性,正態(tài)分布資料選用Pearson's相關(guān)系數(shù),非正態(tài)分布資料選用Spearman相關(guān)系數(shù)；雙熒光素酶活性比較F/R值,方差齊性時(shí)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用近似t檢驗(yàn)。CCK8體外增殖實(shí)驗(yàn)采用析因設(shè)計(jì)的方差分析和單因素方差分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1.MiR-520d-5p在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)(1)miR-520d-5p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：在42對(duì)結(jié)直腸癌患者組織及相應(yīng)配對(duì)正常粘膜上皮中,niR-520d-5p在癌組織的表達(dá)明顯低于正常粘膜組織(P0.01)。臨床病理分析顯示:miR-520d-5p在此42例組織中的表達(dá)暫未發(fā)現(xiàn)與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤大小、漿膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)系(P0.05,P0.05,P0.05,P0.05,P0.05,P0.05,P0.05,P0.05)。(2)miR-520d-5p在高轉(zhuǎn)移性潛能的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)下調(diào)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：在SW480、SW620、HCT116、HT29、 LoVo、DLD-1、LS174T七種細(xì)胞之間的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1651.693,P0.001)。以SW480作為參照,經(jīng)Dunnett T3多重比較發(fā)現(xiàn),miR-520d-5p在SW620和Lovo細(xì)胞中的表達(dá)低于SW480,而miR-520d-5p在HCT116、DLD-1細(xì)胞的表達(dá)高于SW480 (P=0.007;P0.001)。因此,miR-520d-5p在高轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)下調(diào)。2.Cthrcl是miR-520d-5p的靶基因(1)采用miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站(TargetScan、microRNA.org和miRWalk)篩查miR-520d-5p的靶基因,發(fā)現(xiàn)Cthrc1是其預(yù)測(cè)的靶基因。(2)熒光定量RT-PCR和Western Blot檢測(cè)Cthrcl在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá),Cthrcl在癌組織的表達(dá)上調(diào)。相關(guān)性分析顯示：miR-520d-5p與Cthrc1 mRNA在結(jié)直腸癌組織中存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(P0.001,r=-0.555)(3) Western Blot檢測(cè)miR-520d-5p模擬類似物(mimic)及抑制物(inhibitor)轉(zhuǎn)染入SW480、SW620、LoVo、HCT116四株結(jié)直腸癌細(xì)胞株后Cthrc1的表達(dá),顯示：轉(zhuǎn)染入miR-520d-5p mimic后的SW480、SW620、LoVo細(xì)胞中Cthrc1較之NC明顯降低；轉(zhuǎn)染入rniR-520d-5p inhibitor的HCT116細(xì)胞中Cthrc1較之inhibitor-NC組上調(diào)。(4)成功構(gòu)建Wt Cthrc1 3'UTR和Mut Cthrc13'UTR雙熒光素酶報(bào)告載體,HEK293T細(xì)胞中幾乎沒(méi)有miR-520d-5p,將Wt Cthrc1 3'UTR和Mut Cthrc13'UTR以及miR-520d-5p mimic或者陰性對(duì)照(negative control)共轉(zhuǎn)染入SW620、LoVo和HEK293T細(xì)胞中。在SW620細(xì)胞中,在miR-520d-5p存在的情況下,Wt Cthrc1 3'UTR載體的熒光素活性下調(diào)(P0.05),而Mut Cthrc13'UTR雙熒光素活性無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在HEK293T和LoVo細(xì)胞中,在miR-520d-5p存在的情況下,Wt Cthrc1 3'UTR載體的熒光素活性下調(diào),并隨著miR-520d-5p劑量的增加,Wt Cthrc1 3'UTR載體的熒光素活性下調(diào)得更加明顯,50pmol miR-520d-5p mimic較之20pmol引起更加顯著的下調(diào)(P0.01),而Mut Cthrcl 3'UTR雙熒光素活性無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。這表明miR-520d-5p可以與Cthrcl 3'UTR特異性結(jié)合。3.miR-520d-5p通過(guò)抑制Cthrcl的表達(dá)從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)外的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移(1)以空載體病毒(Control)為對(duì)照,在LoVo細(xì)胞中感染miR-50d-5p病毒,建立miR-520d-5p穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LoVo細(xì)胞亞系。與Control組比較,miR-520d-5p在LoVo/miR-520d-5p組細(xì)胞中表達(dá)升高(P0.01)。Western Blot證實(shí)與對(duì)照Control組比較,Cthrcl在LoVo/miR-520d-5p細(xì)胞中表達(dá)降低。(2)熒光定量RT-PCR和Western Blot檢測(cè)顯示：應(yīng)用miR-520d-5p mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染進(jìn)SW480、SW620、LoVo和HCT116細(xì)胞后,與陰性對(duì)照NC組相比,在SW480、SW620、LoVo細(xì)胞mimic組細(xì)胞中,miR-520d-5p表達(dá)上調(diào)(P0.01；P0.01；P0.01),同時(shí)Cthrcl的表達(dá)較之NC組明顯降低。在HCT116細(xì)胞中,miR-520d-5p inhibitor較之inhibitor NC,miR-520d-5p表達(dá)下調(diào)(P0.01),同時(shí)Cthrcl表達(dá)升高。(3)與Vector相比,穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-520d-5p抑制LoVo/miR-520d-5p細(xì)胞的增殖能力(P0.01),克隆形成能力(P0.01),遷移(P0.01)和侵襲能力(P0.01)。(4)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示：較之NC組,SW480/mimic、SW620/mimic、 LoVo/mimic細(xì)胞增殖能力明顯降低(P0.01；P0.01；P0.01)；HCT116/inhibitor較之inhibitor NC細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng)(P0.01)。(5)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明：較之NC組,SW480/mimi、SW620/mimic、 LoVo/mimic細(xì)胞克隆形成能力明顯降低(P0.01；P0.01；P0.01)；HCT116/inhibitor較之inhibitor NC細(xì)胞克隆能力顯著增強(qiáng)(P0.05)。(6)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明：較之NC組,SW480/mimic、SW620/mimic、 LoVo/mimic細(xì)胞遷移能力明顯降低(P0.01；P0.01；P0.01)；HCT116/inhibitor較之inhibitor NC細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)(P0.01),Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。(7)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)表明：LoVo/miR-520d-5p較之LoVo/vector組皮下瘤體積明顯降低(P0.05)。皮下瘤行熒光定量RT-PCR和Western Blot表明：較之LoVo/vector, miR-520d-5p在LoVo/miR-520d-5p組表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05),同時(shí),Cthrcl表達(dá)下調(diào)。皮下瘤免疫組化表明：Ki-67在LoVo/miR-520d-5p組的表達(dá)較LoVo/vector下調(diào)。4.SP1轉(zhuǎn)錄激活miR-520d-5p(1)通過(guò)應(yīng)用UCSC、Ensemble、TFSEARCH、Mapper2.0、Promoter 2.0 Prediction Server等生物信息學(xué)網(wǎng)站篩查,發(fā)現(xiàn)SP1可以與1niR-520d-5p上游啟動(dòng)子序列結(jié)合,是miR-520d-5p潛在的轉(zhuǎn)錄因子。(2)熒光定量RT-PCR檢測(cè)SP1在20對(duì)結(jié)直腸癌組織的表達(dá),顯示SP1在結(jié)直腸癌組織里明顯低表達(dá)(P0.01),并與同一標(biāo)本的miR-520d-5p進(jìn)行表達(dá)相關(guān)性分析,顯示：SP1與miR-520d-5p在結(jié)直腸癌組織里存在明顯正相關(guān)關(guān)系(P0.01)。(3)應(yīng)用靶向針對(duì)SP1的siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)LoVo和SW620細(xì)胞后,經(jīng)Western Blot證實(shí)SP1已被敲低后,以熒光定量RT-PCR檢測(cè)其niR-520d-5p表達(dá)量較之陰性對(duì)照NC組明顯降低(P0.01；P0.05)。(4)擴(kuò)增包含SP1結(jié)合位點(diǎn)的miR-520d-5p啟動(dòng)子序列并將其克隆進(jìn)pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告載體pmirGLO-Wt,同時(shí)對(duì)相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行單獨(dú)突變得到相應(yīng)的突變載體pmirGLO-MutA、pmirGLO-MutB和pmirGLO-MutC。先將SP1 siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T和LoVo細(xì)胞里,24h后再將miR-520d-5p啟動(dòng)子載體轉(zhuǎn)染入HEK293T和LoVo細(xì)胞。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子SP1對(duì)miR-520d-5p活性的影響。結(jié)果顯示：5種熒光素酶報(bào)告載體在HEK293T和LoVo細(xì)胞中有顯著差異(P0.01；P0.01)。在HEK293T細(xì)胞中,與對(duì)照pmirGLO-Basic相比,SP1 siRNA可以降低pmirGLO-Wt、pmirGLO-MutA和pmirGLO-MutB的熒光素酶活性(P0.01；P0.01；P0.01),而不改變pmirGLO-MutC的熒光素酶活性(P0.05)。在LoVo細(xì)胞中,與對(duì)照pmirGLO-Basic相比,SP1 siRNA可以降低pmirGLO-Wt、pmirGLO-MutA和pmirGLO-MutB的熒光素酶活性(P0.01；P0.01；P0.05),而不改變pmirGLO-MutC的熒光素酶活性(P0.05)。以上實(shí)驗(yàn)表明：在結(jié)直腸癌中,SP1可以轉(zhuǎn)錄激活mR-520d-5p的表達(dá)。5.miR-520d-5p調(diào)控結(jié)直腸癌信號(hào)通路的探討(1) Western Blot結(jié)果顯示：和NC組相比,p-ERK1/2在SW480、SW620和LoVo miR-520d-5p mimic處理組中的活性下降,而總蛋白量T-ERK1/2在各細(xì)胞兩處理組間無(wú)顯著差異。隨之EMT標(biāo)記：E-cdherin上調(diào),N-cadherin和vimentin下調(diào)。(2) Western Blot結(jié)果顯示：和inhibitor NC組相比,p-ERKl/2在HCT116miR-520d-5p inhibitor處理組中的活性上調(diào),而總蛋白量T-ERK1/2在細(xì)胞兩處理組間無(wú)顯著差異。隨之EMT標(biāo)記：E-cdherin下調(diào),N-cadherin和vimentin上調(diào)。以上結(jié)果表明：miR-520d-5p可以抑制p-ERK1/2的活性,從而抑制EMT的發(fā)生。即miR-520d-5p通過(guò)抑制Cthrc1抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。結(jié)論1.miR-520d-5p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)；miR-520d-5p在具有高轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。2.Cthrcl是miR-520d-5p的直接靶基因,miR-520d-5p通過(guò)抑制Cthrc1進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。3.SP1通過(guò)與miR-520d-5p上游啟動(dòng)子序列結(jié)合進(jìn)而轉(zhuǎn)錄激活miR-520d-5p的表達(dá)。4.miR-520d-5p抑制p-ERK1/2的活性進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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本文編號(hào)：1203379