本文關(guān)鍵詞：麥冬皂苷B通過miR-34b-5p對非小細胞肺癌A549細胞影響的研究

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【摘要】：研究的目的和意義：肺癌嚴重危害人類健康是目前世界上最常見的惡性腫瘤,在惡性腫瘤所致的死亡中居首位,造成極大的疾病負擔。其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的主要病理類型,占所有肺癌病例的80%以上。隨著綜合治療模式以及分子生物化學的發(fā)展,NSCLC的療效有所提高,但預后仍不理想,5年總生存率不到20%。微小核糖核酸(miRNA)是一類廣泛存在的非編碼蛋白的小分子RNA, miRNA表達及調(diào)控失衡在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年來,隨著對microRNA研究的深入,越來越多的研究顯示miRNA在肺癌的發(fā)展過程中占有重要的地位。其中miR-34b-5p被證實與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。目前中醫(yī)藥在臨床上治療腫瘤已取得顯著療效,相比于西醫(yī)治療腫瘤,中醫(yī)在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和遷移,防止腫瘤復發(fā),穩(wěn)定瘤體,改善患者全身癥狀,提高患者生活質(zhì)量等方面具有明顯優(yōu)勢。“周氏克金巖方”是國醫(yī)大師周仲瑛教授通過長期臨床實踐總結(jié)由養(yǎng)陰益氣、活血祛瘀、燥濕化痰、軟堅散結(jié)等四類功效藥物組成的治療肺癌的有效方劑。經(jīng)高通量篩選,得到對非小細胞肺癌(NSCLC)有細胞毒作用的單體靶點有20余種,包括麥冬皂苷、異甘草素、槲皮素、人參皂苷和聯(lián)芐類化合物等單體化合物。在這張抗肺癌方劑中,麥冬皂苷B (Ophiopogonin B, OP-B)作為一味不可或缺的中藥組分,具有顯著的體外抗癌作用,但其相關(guān)機理有待進一步研究。本實驗通過檢測感染過表達慢病毒LV-hsa-miR-34b的A549細胞以及加入了OP-B的A549細胞中miR-34b-5p及Met的表達,來揭示OP-B抗NSCLC的可能機制。方法：通過閱讀相關(guān)文獻,挑選出數(shù)個對非小細胞肺癌A549細胞有影響的miRNA,通過Real-time PCR技術(shù)從中篩選出加入麥冬皂苷B后差異表達的miRNA,以此miRNA為靶點,通過Real-time PCR技術(shù)比較其在正常胚胎肺成纖維細胞MRC-5細胞以及A549細胞中的表達量,鑒定其在非小細胞肺癌A549的表達特性,判斷其發(fā)揮的作用。構(gòu)建hsa-miR-34b過表達慢病毒載體,用重組質(zhì)粒pHLV-miR-34b感染A549細胞并鑒定轉(zhuǎn)染效率。通過常用的TargetScans、PicTar和PITA等靶基因預測軟件預測miR-34b的潛在靶基因。通過Real-time PCR以及Western Blot技術(shù)從基因水平以及蛋白水平驗證miR-34b-5p和OP-B對Met的影響,通過劃痕實驗和transwell實驗驗證miR-34b-5p對A549細胞遷移和侵襲的影響,以期揭示OP-B可能的抗癌機制。結(jié)果：1. Real-time PCR結(jié)果顯示加入藥物前后miR-21-5p、miR-148a-3p、miR-29a-3p、 miR-338-5p、miR-125a-5p的表達變化不明顯,而miR-34b-5p的表達變化顯著,明顯升高,說明麥冬皂苷B能影響A549細胞中miR-34b-5p的表達。2. Real-time PCR顯示正常胚胎肺成纖維細胞MRC-5細胞中miR-34b-5p的表達量明顯高于非小細胞肺癌A549細胞,說明miR-34b-5p在非小細胞肺癌中發(fā)揮抑癌的作用。3. hsa-miR-34b過表達慢病毒載體的構(gòu)建及效率鑒定的實驗,通過基因測序顯示miR-34b的基因正確地插入到了載體pHLV中,Real-time PCR顯示轉(zhuǎn)染后的細胞miR-34b-5p的表達量明顯升高,熒光鏡下可見發(fā)光蛋白,說明重組慢病毒質(zhì)粒成功感染A549細胞。4.通過查閱相關(guān)文獻并利用生物學靶基因預測軟件分析,發(fā)現(xiàn)miR-34b預測的靶基因中包括met,且提示met可能是miR-34b-5p的關(guān)鍵下游靶基因。5. Real-time PCR以及Western Blot結(jié)果示Micro-up組和OP-B組細胞Met的表達低,而A549組和NC組Met的表達高。6.劃痕實驗和transwell實驗結(jié)果顯示Micro-up組細胞遷移和侵襲慢,而NC組細胞遷移和侵襲快。結(jié)論：1.麥冬皂苷B能顯著降低非小細胞肺癌A549細胞中miR-34b-5p的表達水平。2. miR-34b-5p在非小細胞肺癌A549細胞中表達下調(diào),發(fā)揮抗癌作用。3.met是miR-34b-5p的靶標基因。4.外源性上調(diào)miR-34b-5p的表達,可在基因和蛋白水平下調(diào)Met的表達；加入麥冬皂苷B,也可在基因和蛋白水平下調(diào)Met的表達。麥冬皂苷B可能通過上調(diào)A549細胞miR-34b-5p表達,進而抑制下游靶基因met的表達而發(fā)揮抗癌作用。5.外源性上調(diào)miR-34b-5p的表達,可抑制A549細胞的遷移和侵襲。
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1203258