本文關(guān)鍵詞：論文一：IL-17D在肺臟腫瘤免疫編輯中的作用 論文二：小劑量全身輻射后T細(xì)胞免疫重建特點(diǎn)及肉桂的調(diào)節(jié)作用

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【摘要】：研究背景:肺癌是世界最常見的惡性腫瘤之一,臨床診斷發(fā)現(xiàn)時(shí)肺癌往往已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近年來,越來越多的研究開始關(guān)注腫瘤微環(huán)境在肺癌中的作用。2002年美國(guó)生物學(xué)家Shreigber提出腫瘤免疫編輯(tumor immunoediting)學(xué)說,該理論認(rèn)為腫瘤發(fā)展包括3個(gè)階段,即清除(elimination)、平衡(equilibrium)及逃逸(escape)。隨著免疫編輯的進(jìn)展,腫瘤細(xì)胞不斷增值、惡化,同時(shí)伴隨抗腫瘤免疫的失勢(shì),以及局部組織結(jié)構(gòu)的破壞。而局部組織結(jié)構(gòu)的破壞(包括局域細(xì)胞因子及趨化因子分泌模式的改變)又影響淋巴細(xì)胞的局部招募及功能表型,從而加速了免疫失勢(shì),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤惡化,如此形成惡性循環(huán)。組織基質(zhì)細(xì)胞是最早感知免疫編輯的細(xì)胞群體,其如何通過細(xì)胞因子及趨化因子影響免疫失勢(shì)研究較少,是我們關(guān)注的焦點(diǎn)。IL-17家族是感知粘膜組織破壞最為敏感的危險(xiǎn)感受器(danger sensor),其家族成員中,關(guān)于IL-17D的研究很少,有研究指出其主要表達(dá)于肺臟、骨骼肌,我們前期的研究發(fā)現(xiàn)IL-17D主要由CD45-細(xì)胞表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,了解IL-17D在肺臟組織中的具體來源細(xì)胞,闡明其在肺癌局域微環(huán)境中的作用。并探討NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞肺臟遷移模式、表型特征和功能變化規(guī)律,認(rèn)識(shí)IL-17D缺失影響NK細(xì)胞肺臟遷移、表型和功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究目的:1.我們前期的研究發(fā)現(xiàn)肺臟中IL-17D主要由CD45-細(xì)胞表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,在小鼠肺臟腫瘤生長(zhǎng)過程中,針對(duì)肺臟幾種基質(zhì)細(xì)胞,探討肺臟IL-17D的主要細(xì)胞來源和表達(dá)變化趨勢(shì)。2.明確NK、CD8+T細(xì)胞肺臟遷移模式、表型特征和功能變化規(guī)律,認(rèn)識(shí)IL-17D缺失影響NK細(xì)胞肺臟遷移、表型和功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究方法:1.建立B16轉(zhuǎn)移性肺癌、皮膚癌、小腸癌小鼠模型;采用滴鼻吸入IL-17D制劑的方式給予小鼠外源性補(bǔ)充IL-17D。2.實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠肺臟、皮膚、小腸組織的IL-17D表達(dá);q-PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠肺臟趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、S1Pr5及細(xì)胞因子S1Pr1、IL-12、IL-15、GM-CSF、IL-22、IL-23、IL-1β、TNF-a的m RNA表達(dá)。3.流式細(xì)胞胞內(nèi)外因子雙染法檢測(cè)小鼠肺臟成纖維細(xì)胞的IL-17D分泌水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺臟CD4+T、CD8+T、NK細(xì)胞比例及其分泌IFN-γ水平。4.采用膠原酶消化法及組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原代小鼠肺成纖維細(xì)胞及人胚胎肺成纖維細(xì)胞,并采用差時(shí)貼壁法進(jìn)行純化,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志進(jìn)行鑒定。5.腫瘤細(xì)胞與肺成纖維細(xì)胞不同比例共培養(yǎng),腫瘤培養(yǎng)上清與肺成纖維細(xì)胞不同濃度共培養(yǎng),RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞IL-17D、CXCL9、CXCL10的m RNA表達(dá)。6.為進(jìn)一步驗(yàn)證IL-17D對(duì)肺臟成纖維細(xì)胞局域招募NK及CD8+T細(xì)胞的影響及機(jī)制,將肺成纖維細(xì)胞種于下室,采用肺癌細(xì)胞LLC細(xì)胞上清及IL-17D對(duì)肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行刺激,并將其與外周血、肺臟、脾臟中的淋巴細(xì)胞采用Transwell共培養(yǎng),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)進(jìn)入下室的淋巴細(xì)胞中NK及CD8+T細(xì)胞的比例。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)下室肺成纖維細(xì)胞IL-17D、CXCL10、IL-15的m RNA表達(dá)。研究結(jié)果:1.IL-17D在腫瘤組織中表達(dá)下降。q-PCR及流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示,在肺臟中,IL-17D主要由CD45-細(xì)胞表達(dá);IL-17D在B16轉(zhuǎn)移性肺癌、皮膚癌、腸癌組織中的蛋白及m RNA表達(dá)均顯著下降(P0.05),在肺癌組織中的降低尤為明顯。另外,在B16轉(zhuǎn)移性肺癌組織中,IL-17D的m RNA表達(dá)水平隨時(shí)間呈遞減趨勢(shì)。2.肺臟中IL-17D的細(xì)胞來源。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,肺臟中CD45-IL-17D+的細(xì)胞中有40~80%是成纖維細(xì)胞(CD45-CD140a+)。另外,流式細(xì)胞胞內(nèi)外因子雙染法表明,肺臟成纖維細(xì)胞分泌的IL-17D在小鼠B16轉(zhuǎn)移性肺癌中顯著減少(P0.05)。3.B16轉(zhuǎn)移性肺癌局域浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的表達(dá)模式。流式結(jié)果顯示,B16轉(zhuǎn)移性肺癌局部浸潤(rùn)的CD3+T、CD8+T及NK細(xì)胞比例均顯著降低(P0.05),CD4+T無明顯變化;另外,NK細(xì)胞分泌的IFN-γ明顯減少(P0.05),而CD4+T、CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ無顯著變化。4.B16轉(zhuǎn)移性肺癌局域趨化因子及細(xì)胞因子分泌模式。肺臟成纖維細(xì)胞可分泌CXCL9、CXCL10、GM-CSF、IL-1β、TNFa和IL-23等多種因子,不但可以募集多種淋巴細(xì)胞的局部聚集,也影響原位淋巴細(xì)胞的表型和功能。q-PCR結(jié)果顯示,與正常對(duì)照小鼠相比,B16轉(zhuǎn)移性肺癌小鼠肺臟CXCL9、CXCL10的m RNA表達(dá)水平顯著下降(P0.05);S1Pr1、IL-12、IL-15、GM-CSF的m RNA表達(dá)均明顯下調(diào)(P0.05)。5.IL-17D抑制小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移。與PBS對(duì)照組相比,IL-17D滴鼻小鼠的肺臟腫瘤克隆數(shù)顯著下降(P0.05),并且伴隨肺臟局部浸潤(rùn)C(jī)D8+T及NK細(xì)胞比例顯著增加(P0.05);另外,q-PCR結(jié)果顯示,IL-17D滴鼻小鼠的肺臟CXCL9、CXCL10、GM-CSF的m RNA表達(dá)水平明顯上升(P0.05),表明IL-17D可能是通過CXCL9、CXCL10趨化NK、CD8+T細(xì)胞至腫瘤局部,發(fā)揮抗腫瘤作用。6.腫瘤細(xì)胞抑制原代肺成纖維細(xì)胞IL-17D表達(dá)。B16腫瘤細(xì)胞與小鼠肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后收集細(xì)胞做RT-PCR,結(jié)果顯示,B16細(xì)胞可明顯抑制成纖維細(xì)胞IL-17D及趨化因子CXCL9、CXCL10的m RNA表達(dá),且抑制效果與共培養(yǎng)比例呈正相關(guān)。另外人肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)上清可顯著抑制原代人胚胎肺成纖維細(xì)胞的增殖及IL-17D及CXCL9、CXCL10的m RNA表達(dá),且抑制效果呈濃度依賴性。7.IL-17D對(duì)肺成纖維細(xì)胞體外趨化NK及CD8+T細(xì)胞的影響。流式細(xì)胞術(shù)顯示,與對(duì)照組(下層不接種細(xì)胞)相比,肺成纖維細(xì)胞可有效趨化肺臟、外周血及脾臟NK及CD8+T細(xì)胞進(jìn)入下室。經(jīng)LLC上清刺激培養(yǎng)后,肺成纖維細(xì)胞對(duì)NK及CD8+T細(xì)胞的趨化作用顯著減弱(P0.05),若同時(shí)加入r m IL-17D刺激,則肺成纖維細(xì)胞對(duì)NK及CD8+T細(xì)胞的趨化作用明顯增加(P0.05),且與r m IL-17D劑量成正相關(guān)。另外,通過收集下室肺成纖維細(xì)胞做RT-PCR,結(jié)果顯示,經(jīng)LLC上清刺激后,肺成纖維細(xì)胞IL-17D、CXCL10及IL-15的m RNA表達(dá)水平顯著下調(diào),若同時(shí)加入r m IL-17D刺激,則肺成纖維細(xì)胞IL-17D、CXCL10及IL-15的m RNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。結(jié)論:1.肺臟成纖維細(xì)胞分泌的IL-17D在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用:肺癌中成纖維細(xì)胞分泌IL-17D減少可引起趨化因子CXCL9、CXCL10及細(xì)胞因子IL-12、IL-15、GM-CSF表達(dá)降低,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤局域募集的NK、CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少、功能減弱,從而促進(jìn)腫瘤肺轉(zhuǎn)移。2.成纖維細(xì)胞分泌的IL-17D通過CXCL9、CXCL10趨化NK細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞至腫瘤局部,發(fā)揮抗腫瘤作用。研究背景:根據(jù)聯(lián)合國(guó)原子輻射影響問題科學(xué)委員會(huì)近期發(fā)表的一份報(bào)告指出,在全世界人口遭受的由自然或人為因素導(dǎo)致的各種輻射中,有接近20%來自醫(yī)療輻射。輻射(irradiation,IR)對(duì)放療病人及從業(yè)人員的損傷已引起社會(huì)廣泛關(guān)注,其通過產(chǎn)生反應(yīng)氧和自由基,可造成機(jī)體活細(xì)胞尤其是免疫細(xì)胞形態(tài)與功能的損傷。臨床腫瘤放療產(chǎn)生的副作用,在免疫系統(tǒng)可表現(xiàn)為具有免疫抑制作用或促腫瘤作用的一些細(xì)胞亞群如Treg、Th17、MDSC等的累積。T細(xì)胞是高度異質(zhì)性的細(xì)胞群體。其中,CD4+初始T細(xì)胞在不同細(xì)胞因子微環(huán)境下,可以向不同細(xì)胞亞群如Th1、Th2、Th17及Treg等分化,從而介導(dǎo)不同免疫功能。這些細(xì)胞亞群之間相互促進(jìn)、相互抑制,共同打造機(jī)體有效的抗腫瘤免疫微環(huán)境,因此,輻射損傷后T細(xì)胞亞群的免疫重建能力直接關(guān)系到機(jī)體的抗腫瘤作用。肉桂(cinnamon)具有滋養(yǎng)肝腎的作用,其作為香料和調(diào)味品在全世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。作為組方藥,肉桂常用于治療糖尿病、關(guān)節(jié)炎、腫瘤等,而其在輻射后靶向T細(xì)胞的作用尚不明確。研究目的:1.觀察小劑量全身輻射損傷后小鼠T細(xì)胞亞群免疫重建的特點(diǎn),為臨床如何利用機(jī)體自身的免疫修復(fù)能力科學(xué)選擇腫瘤放療頻率和時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.輻射損傷后免疫重建受損會(huì)削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫,本研究探討輻射后機(jī)體免疫重建受損對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響及肉桂的調(diào)節(jié)作用,為臨床腫瘤放療病人藥物輔助治療提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。研究方法:1.肉桂水提液的制備:采用傳統(tǒng)法水煎、醇沉、回收乙醇,制備成肉桂水提液。2.輻射損傷模型及肉桂制劑的干預(yù)方法:采用X射線2.5 Gy單次全身照射建立小鼠輻射損傷模型;在小鼠于飲用水中給予0.1%水提液建立肉桂處理模型。3.腫瘤模型的建立:采用B16細(xì)胞2×105個(gè)尾靜脈注射,建立轉(zhuǎn)移性肺癌模型。4.采用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)小鼠血常規(guī)變化。5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血、脾臟中CD3+T、CD4+T、CD8+T變化以及脾臟中CD80、CD86、MHC-I、MHC-II的表達(dá)水平。6.胞內(nèi)外染色法分析小鼠脾臟及肺臟中CD4+T細(xì)胞各亞群Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)、Tc1(CD3+CD8+IFN-γ+)、Th2(CD3+CD4+IL-4+)、Th17(CD3+CD4+IL-17A+)、Treg(CD4+CD25+foxp3+)及IFN-γ+IL-17A+Th17細(xì)胞的比例變化。7.逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞各亞群特征性核轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、RORγT、Foxp3的m RNA水平的變化;RT-PCR技術(shù)檢測(cè)IL-12、IL-15、IL-23的m RNA水平變化。8.利用解剖顯微鏡觀察輻射前后及肉桂處理前后小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移克隆數(shù)變化。研究結(jié)果:1.淋巴細(xì)胞是應(yīng)對(duì)輻射最敏感的細(xì)胞群體。在血常規(guī)的幾項(xiàng)指標(biāo)中,淋巴細(xì)胞比例在輻射后第3、5天顯著下降(P0.05),在輻射后第5天開始恢復(fù),在10天較第3天顯著增加(P0.05),開始恢復(fù)。單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白無顯著變化。2.輻射損傷后T細(xì)胞亞群變化特點(diǎn)。脾臟和外周血中的CD3+T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的比例在第3、5天顯著降低(P0.05),在第10天開始恢復(fù)。CD3+T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)也發(fā)生同步改變。CD4+T細(xì)胞比例在第5天降到最低,在第8天開始恢復(fù)。CD8+T細(xì)胞比例和絕對(duì)數(shù)在第3天降至最低,在第5天已開始恢復(fù),CD4+T細(xì)胞的免疫重建較CD8+T細(xì)胞延遲。另外,共刺激分子CD80、CD86及MHC-II水平及IL-12、IL-15、IL-23的m RNA表達(dá)在輻射后第5天顯著降低(P0.05),在輻射后第10天明顯增加(P0.05)。3.輻射損傷后CD4+T細(xì)胞各亞群變化特點(diǎn)。通過檢測(cè)脾臟中Tc1、Th1、Th2、Th17、Treg在T細(xì)胞中所占比例,進(jìn)一步觀察了CD4+T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌模式,結(jié)果顯示,在輻射后第10天,伴隨著CD4+T細(xì)胞總體水平的恢復(fù),CD4+T細(xì)胞各亞群仍處于失衡狀態(tài),表現(xiàn)為:與對(duì)照組相比,Tc1、Th1亞群比例和絕對(duì)數(shù)顯著下降(P0.05),Th2、Th17、Treg亞群比例則明顯增加(P0.05)。具有抗腫瘤作用的IFNγ+IL-17A+Th17亞群比例顯著降低(P0.05)。4.肉桂調(diào)節(jié)輻射損傷后T細(xì)胞亞群免疫重建作用。與輻射模型組相比,肉桂處理小鼠的Th1、Tc1亞群比例及細(xì)胞數(shù)顯著上升(P0.05),Th17亞群比例明顯降低(P0.05),Treg細(xì)胞比例及絕對(duì)數(shù)均顯著下降(P0.05),Th2亞群無明顯變化。IFNγ+IL-17A+Th17亞群比例明顯增加(P0.05)。5.CD4+T細(xì)胞各亞群的特征性核轉(zhuǎn)錄因子變化。與對(duì)照組相比,照射后第10天小鼠T-bet的m RNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P0.05),GATA3、RORγT、Foxp3的m RNA表達(dá)水平則明顯上調(diào)(P0.05);與照射小鼠相比,肉桂處理小鼠T-bet的m RNA表達(dá)水平顯著增高(P0.05),Foxp3的m RNA表達(dá)水平則明顯降低(P0.05),GATA3則無顯著變化。這些變化與CD4+T細(xì)胞各亞群變化一致。6.肉桂加強(qiáng)了輻射損傷小鼠對(duì)抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。與B16小鼠相比,輻射后B16小鼠肺部的腫瘤克隆數(shù)顯著增加(P0.05);與輻射后B16小鼠相比,肉桂處理的輻射后B16小鼠肺部腫瘤克隆數(shù)明顯降低(P0.05)。7.輻射損傷前后肺部腫瘤局域T細(xì)胞亞群變化特征。與正常B16小鼠相比,輻射損傷后B16小鼠肺臟腫瘤浸潤(rùn)Th1、Tc1比例顯著降低(P0.05),肉桂處理后,Th1、Tc1比例顯著增加(P0.05),這些變化也與腫瘤發(fā)展一致。結(jié)論:1.T淋巴細(xì)胞在輻射后第3-5天降至最低,在第10天恢復(fù)至正常水平,其中CD4+T細(xì)胞免疫重建較CD8+T細(xì)胞延遲。2.小劑量全身輻射損傷后T細(xì)胞亞群免疫重建特點(diǎn)表現(xiàn)為Th1的劣勢(shì),及Th17、Treg的相對(duì)優(yōu)勢(shì),這種狀態(tài)促進(jìn)了腫瘤轉(zhuǎn)移。肉桂通過促進(jìn)Th1亞群增殖,抑制Th17及Treg亞群,從而有效逆轉(zhuǎn)輻射損傷后T細(xì)胞亞群失衡,從而加強(qiáng)抗腫瘤免疫。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 Priyanka Pahan;Kalipada Pahan;;Can cinnamon bring aroma in Parkinson's disease treatment?[J];Neural Regeneration Research;2015年01期

2 吳安慶;陳秋;劉偉;崔鳳梅;鄭璐琳;李磊;張學(xué)光;;X射線全身照射對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的損傷效應(yīng)[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2013年03期

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本文編號(hào)：1201678