本文關(guān)鍵詞：截短型PF4慢病毒載體的構(gòu)建及抗血管新生活性研究

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【摘要】：血管新生對于實體瘤的生長與轉(zhuǎn)移是一個關(guān)鍵步驟,抑制腫瘤血管的生成可以達(dá)到抑制腫瘤生長的目的,因此以腫瘤血管新生為靶點的治療策略逐漸發(fā)展成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究重點。血小板因子4(platelet factor-4,PF4)是一種內(nèi)源性抗血管生成因子,它通過多種機(jī)制抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖,以此抑制血管生成。慢病毒載體作為一種常用且研究較多的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),以其能轉(zhuǎn)染較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組織,將治療基因安全有效的整合到靶細(xì)胞基因組中,目的基因表達(dá)穩(wěn)定持久、轉(zhuǎn)移基因容量較大等優(yōu)勢,在基因治療中扮演重要角色。隨著研究的深入,慢病毒載體在腫瘤基因治療方面也取得了很大進(jìn)展。本課題構(gòu)建了攜帶截短型血小板因子4片段——PF447-70-RGD的慢病毒表達(dá)載體,將其包裝為活性病毒,并以其介導(dǎo)的PF447-70-RGD為研究對象,探討其體外抑制血管新生的生物學(xué)活性,為抗血管生成基因療法治療腫瘤奠定了基礎(chǔ)。本研究首先將血小板因子4片段PF447-70-RGD,從保存的載體pcDNA3.1(+)-PF447-70-RGD上擴(kuò)增出來,然后將其插入慢病毒表達(dá)載體pLV-MCS-Bsd中,構(gòu)建出慢病毒表達(dá)載體pLV-PF447-70-RGD。其次,將構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)載體連同慢病毒包裝系統(tǒng)的三個輔助質(zhì)粒,共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行慢病毒的包裝生產(chǎn),應(yīng)用實時熒光定量PCR法(Realtime Quantitative PCR,Q-PCR)測定收獲病毒的滴達(dá)6.16×107IU/ml。再次,將獲得的空載慢病毒(pLV-MCS-Bsd)和重組慢病毒(pLV-PF447-70-RGD)分別感染人肺腺癌A549細(xì)胞系,在殺稻瘟菌素(Blasticidin,Bsd)壓力下篩選出對應(yīng)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,然后在基因水平上通過RT-PCR,蛋白水平上通過Western Blot來檢測PF447-70-RGD重組肽的表達(dá)。最后,進(jìn)行體外活性實驗,研究重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的PF447-70-RGD基因功能及感染的A549細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌的重組肽的功能,即收集病毒顆粒和穩(wěn)轉(zhuǎn)PF447-70-RGD的A549細(xì)胞的培養(yǎng)液,用MTT法檢測對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖的作用,并觀察穩(wěn)轉(zhuǎn)PF447-70-RGD的A549細(xì)胞培養(yǎng)液對HUVEC小管形成的影響。結(jié)果表明:實驗組相對于對照組,能明顯抑制HUVEC細(xì)胞增殖,抑制率為36.7%,而且能夠顯著抑制HUVEC細(xì)胞小管形成。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.5

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9 張U，

本文編號：1188219