本文關(guān)鍵詞：不可逆性電穿孔消融宮頸癌細(xì)胞后殘留細(xì)胞生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：宮頸癌為女性生殖系統(tǒng)最常見的三大惡性腫瘤之一。近年來其發(fā)病呈現(xiàn)出新特點(diǎn)：年輕化。目前宮頸癌的治療方式主要包括手術(shù)、化療及放療,多數(shù)患者均能取得很好的治療效果,但術(shù)后其生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能可受到一定的影響。然而年輕的患者保留生育功能的愿望強(qiáng)烈。因此,找到一種治療方法,既可以有效的治療腫瘤,又可保留患者的生育功能和性功能,成為近年來研究的熱點(diǎn)。脈沖電場為一種新興的物理消融腫瘤的方法。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在不同脈寬及電場強(qiáng)度的脈沖作用下產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng),從細(xì)胞的可逆性穿孔、不可逆性穿孔到細(xì)胞內(nèi)處理效應(yīng)。不可逆性電穿孔因其可擊穿細(xì)胞膜,直接殺滅腫瘤細(xì)胞,被廣泛用于腫瘤物理消融的研究。目前大量的研究均已證實(shí)了不可逆性電穿孔殺滅腫瘤的有效性。并總結(jié)出不可逆電穿孔消融腫瘤具有治療時(shí)間短,療效不依賴熱效應(yīng),不受靶區(qū)血流的影響,可根據(jù)電極針的布陣和脈沖參數(shù)的選擇使得治療范圍精確可控等優(yōu)點(diǎn)。因此,不可逆電穿孔以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。腫瘤因其侵潤性生長特性常與周圍正常組織邊界不清,因此在消融過程中脈沖電場作用區(qū)域的邊緣難免會殘留腫瘤細(xì)胞。而這些殘存的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的變化是影響疾病預(yù)后的關(guān)鍵。不可逆電穿孔消融后殘留腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的研究目前甚少。因此,本課題以宮頸癌Hela、Siha細(xì)胞株為研究對象,采用亞致死劑量的脈沖電場消融腫瘤細(xì)胞。檢測脈沖電場處理后殘留腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的變化,包括其增殖、遷移、侵襲、粘附能力及對順鉑敏感性的改變,并初步探討其改變可能發(fā)生的分子機(jī)制。第一部分不可逆性電穿孔消融宮頸癌細(xì)胞后殘留細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的研究第一節(jié)亞致死劑量脈沖電場參數(shù)的篩選目的：篩選不可逆性電穿孔體外消融宮頸癌細(xì)胞的亞致死劑量脈沖電場參數(shù)。方法：根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定參數(shù)并分為三個(gè)不同脈沖作用個(gè)數(shù)的實(shí)驗(yàn)組(8個(gè)、16個(gè)、24個(gè)),固定參數(shù)為：電壓400V,脈寬100us,頻率1Hz。試驗(yàn)中電擊小室兩電極之間距離為4mm,根據(jù)公式場強(qiáng)＝電壓/距離,本實(shí)驗(yàn)中場強(qiáng)為1000V/cm。將制備好的Hela、Siha細(xì)胞懸液加入電擊小室中,分別施加上述三個(gè)不同參數(shù)的脈沖電場處理,對照組細(xì)胞懸液不予以脈沖電場處理。脈沖電場處理后立即采用cck-8法檢測各組細(xì)胞活性,計(jì)算存活率,選取接近半數(shù)抑制Hela、Siha細(xì)胞活性的脈沖電場參數(shù)。結(jié)果：脈沖電場處理后,cck-8法檢測細(xì)胞活性可觀察到Hela細(xì)胞8、16個(gè)和24個(gè)脈沖組細(xì)胞存活率分別為(78.73±7.21)%,(62.95±10.01)%,(39.45±3.11)%,Siha細(xì)胞為(76.23±6.91)%, (61.58±8.28)%,(37.65±2.98)%,Hela、Siha細(xì)胞3個(gè)組之間細(xì)胞存活率比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。其中以16個(gè)脈沖個(gè)數(shù)組的細(xì)胞存活率最接近50%。結(jié)論：我們選擇不可逆性電穿孔消融宮頸癌細(xì)胞的亞致死劑量參數(shù)為：場強(qiáng)1000V/cm,脈寬100us,頻率1Hz,脈沖個(gè)數(shù)16個(gè)。第二節(jié)亞致死劑量不可逆性電穿孔對宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響目的：觀察亞致死劑量不可逆性電穿孔對人宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響方法：體外培養(yǎng)宮頸癌Hela、Siha細(xì)胞株,分為脈沖組和對照組。脈沖組給予固定參數(shù)的脈沖電場處理(場強(qiáng)1000V/cm,脈寬100μs,頻率1Hz,脈沖個(gè)數(shù)16個(gè)),對照組不予脈沖處理。采用cck-8法檢測細(xì)胞活性,計(jì)算生存率,描記生長曲線。PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。CFSE熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞分裂增殖情況。同時(shí)采用劃痕實(shí)驗(yàn)及transwel1小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。Transwell侵襲試驗(yàn)及基質(zhì)膠粘附實(shí)驗(yàn)分別檢測細(xì)胞侵襲和黏附能力。結(jié)果：脈沖電場處理后24h,cck-8檢測細(xì)胞活性示Hela、Siha細(xì)胞生長呈下降趨勢,生長受到抑制。PI染色檢測細(xì)胞周期顯示脈沖電場處理后24h,Hela和Siha細(xì)胞處于G1期細(xì)胞明顯增加(P0.05),S期細(xì)胞明顯下降(P0.05),細(xì)胞周期阻滯在G1期。CFSE熒光標(biāo)記檢測細(xì)胞增殖結(jié)果表明,脈沖處理后,Hela和Siha細(xì)胞分裂增殖能力明顯受到抑制,處于分裂增殖后的第5-6代細(xì)胞較對照組明顯減少(P0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell小室遷移、transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)和基質(zhì)膠粘附試驗(yàn)結(jié)果顯示,脈沖處理后,細(xì)胞的遷移能力,侵襲能力和粘附能力均未受到明顯的影響,各實(shí)驗(yàn)組與對照組結(jié)果經(jīng)分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論：亞致死劑量不可逆性電穿孔消融宮頸癌細(xì)胞Hela、Sih a后,細(xì)胞的增殖能力受到明顯的抑制。而細(xì)胞的遷移、侵襲和粘附能力未受到明顯的影響。第三節(jié)亞致死劑量不可逆性電穿孔影響宮頸癌細(xì)胞增殖能力的分子機(jī)制目的：初步探討亞致死劑量不可逆性電穿孔消融宮頸癌Hela、Siha細(xì)胞后影響細(xì)胞增殖能力的分子機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)分組同前。脈沖處理后24h,收集各組細(xì)胞提取蛋白,采用Western Blot法檢測各組細(xì)胞增殖相關(guān)基因P53、P21、CDK2、PCNA的表達(dá)水平。結(jié)果：脈沖電場處理后,Hela口Siha脈沖組細(xì)胞P53、P21的表達(dá)水平高于對照組,PCNA、CDK2表達(dá)較對照組減少(P0.05)。結(jié)論：不可逆性電穿孔對宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響可能通過促進(jìn)P53-P21-CDK2信號通路的表達(dá)及下調(diào)PCNA的表達(dá)。第二部分不可逆性電穿孔消融宮頸癌細(xì)胞后殘留細(xì)胞對順鉑敏感性的研究目的：研究亞致死劑量不可逆性電穿孔消融宮頸癌細(xì)胞對細(xì)胞順鉑敏感性的影響,并初步探討其影響機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)宮頸癌Hela、Siha細(xì)胞株,分為脈沖組和處理組,脈沖組細(xì)胞給予亞致死劑量的脈沖電場治療(場強(qiáng)1000V/cm,脈寬100us,頻率1Hz,脈沖個(gè)數(shù)16個(gè))。對照組不予電場治療。對照組、脈沖組細(xì)胞均予以相同濃度的順鉑(5ug/m1、10ug/ml、15ug/ml、無順鉑)處理24h。采用cck-8檢測細(xì)胞活性,計(jì)算順鉑抑制率,對比分析脈沖組和對照組順鉑抑制率差異。收集脈沖治療組和對照組經(jīng)順鉑溶液處理后的細(xì)胞,裂解收集細(xì)胞內(nèi)液,采用高效液相色譜法(HPLC)檢測各組細(xì)胞內(nèi)液順鉑的濃度。收集細(xì)胞蛋白用于Western Blot法檢測銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CTR1)的表達(dá)水平。結(jié)果：cck-8檢測細(xì)胞活性結(jié)果顯示脈沖處理后,不同濃度的順鉑對細(xì)胞的抑制率均明顯上升(P0.05)。細(xì)胞內(nèi)順鉑濃度檢測結(jié)果顯示,兩種細(xì)胞脈沖處理組細(xì)胞內(nèi)順鉑濃度均高于對照組(P0.05)。Western Blot檢測細(xì)胞銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CTR1)的表達(dá)水平提示脈沖組銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CTR1)的表達(dá)水平較對照組升高(P0.05)。結(jié)論：亞致死劑量不可逆性電穿孔可增加宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性,其可能的機(jī)制為通過增加銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CTR1)的表達(dá),使得順鉑進(jìn)入細(xì)胞的量增加。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33

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