本文關(guān)鍵詞：Snf5和Ezh2調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 自噬 惡性橫紋肌樣瘤 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 Snf5 Ezh2 LC3

【摘要】：目的:探討染色體重塑復(fù)合物SWI/SNF核心亞基Snf5和組蛋白甲基化酶Ezh2調(diào)控自噬發(fā)生的作用和作用機(jī)制。方法:第一部分:取基因型均為Snf5flox/flox的雄鼠和雌鼠合籠交配,通過(guò)陰道栓確認(rèn)懷孕,13天后解剖懷孕母鼠取出胚胎,制備基因型為Snf5flox/flox的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng)、傳代,并凍存細(xì)胞。將腺病毒表達(dá)質(zhì)粒YFP-Cre和包膜質(zhì)粒10A1共轉(zhuǎn)染入人腎上皮細(xì)胞系293t細(xì)胞,包裝出腺病毒,使用病毒液感染制備好的基因型為Snf5flox/flox的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。流式篩選出Snf5-/-細(xì)胞,利用EBSS培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理,Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中自噬標(biāo)記LC3-I、LC3-II表達(dá)量變化,檢測(cè)自噬水平變化。第二部分:利用已有的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中敲除Snf5基因后的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),進(jìn)行基因集富集分析。選取Snf5缺失的BT12、G401惡性橫紋肌樣瘤MRT(malignant rhabdoid tumor)細(xì)胞系,以Hela子宮頸癌細(xì)胞系作為對(duì)照,分別使用EBSS培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行梯度時(shí)間饑餓處理,Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中LC3-I、LC3-II表達(dá)量變化,檢測(cè)自噬水平變化。使用Ezh2小分子抑制劑EPZ6438,分別以一定的濃度梯度處理Snf5缺失的A204、G401細(xì)胞,Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H3K27me3水平和LC3-I、LC3-II表達(dá)量變化,檢測(cè)自噬水平變化。結(jié)果:第一部分:利用Cre-loxP系統(tǒng),將包裝好的表達(dá)Cre酶的腺病毒感染Snf5flox/flox小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)篩選出Snf5-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,使用EBSS進(jìn)行梯度時(shí)間饑餓處理后,Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Snf5-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在饑餓處理0h時(shí)LC3-II水平就明顯升高,提示在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中敲除Snf5可能誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬的發(fā)生。第二部分:基因富集分析的結(jié)果顯示,在敲除了Snf5小鼠胚胎成纖維細(xì)胞基因表達(dá)變化的排序中,成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因RB下游相關(guān)基因的基因集在頂端發(fā)生明顯富集,而轉(zhuǎn)錄因子E2F的靶基因與自噬調(diào)控相關(guān),揭示可能Snf5缺失引起的RB/E2F信號(hào)通路異常影響了自噬。使用EBSS培養(yǎng)液對(duì)Hela、BT12、G401細(xì)胞系進(jìn)行梯度時(shí)間饑餓處理,Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Hela細(xì)胞中LC3-II的水平無(wú)明顯變化,而Snf5缺失的BT12、G401細(xì)胞中LC3-II水平在饑餓1h時(shí)就明顯升高,揭示誘導(dǎo)自噬發(fā)生。EPZ6438是一種Ezh2小分子抑制劑,能夠通過(guò)抑制Ezh2活性而降低H3K27me3的水平。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,使用EPZ6438處理A204、G401惡性橫紋肌樣瘤細(xì)胞系時(shí),均在抑制劑濃度為10μM,處理96h后,H3K27me3水平明顯降低,同時(shí)LC3-II的水平明顯升高,揭示誘導(dǎo)自噬發(fā)生。結(jié)論:1、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的自噬可能是受Snf5調(diào)控的。敲除Snf5基因后,小鼠胚胎成纖維細(xì)胞自噬水平明顯升高。2、在敲除了Snf5小鼠胚胎成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜變化排序中,并未發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因集在其頂部或底部富集,而結(jié)果顯示,成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因RB下游相關(guān)基因的基因集在其頂部明顯富集,揭示可能Snf5缺失引起的RB/E2F信號(hào)通路異常影響了自噬。3、饑餓誘導(dǎo)自噬,相較于子宮頸癌Hela細(xì)胞系,Snf5缺失的惡性橫紋肌樣瘤A204、G401細(xì)胞系具有較高敏感度的自噬活性,揭示干預(yù)MRT細(xì)胞自噬可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的治療方向。4、在Snf5缺失的MRT細(xì)胞中,EPZ6438可以通過(guò)抑制Ezh2酶活性降低H3K27me3水平,使LC3-II表達(dá)水平增高,誘導(dǎo)自噬發(fā)生。揭示Ezh2催化的H3K27me3可能參與調(diào)節(jié)自噬,將Ezh2作為藥物靶點(diǎn)并聯(lián)合使用調(diào)控自噬類藥物,可能會(huì)加強(qiáng)對(duì)MRT細(xì)胞的殺傷作用。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R738.7

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本文編號(hào)：1181144