發(fā)布時間：2017-11-13 14:43

  本文關鍵詞：Snf5和Ezh2調(diào)節(jié)細胞自噬的實驗研究

  更多相關文章： 自噬 惡性橫紋肌樣瘤 小鼠胚胎成纖維細胞 Snf5 Ezh2 LC3

【摘要】：目的:探討染色體重塑復合物SWI/SNF核心亞基Snf5和組蛋白甲基化酶Ezh2調(diào)控自噬發(fā)生的作用和作用機制。方法:第一部分:取基因型均為Snf5flox/flox的雄鼠和雌鼠合籠交配,通過陰道栓確認懷孕,13天后解剖懷孕母鼠取出胚胎,制備基因型為Snf5flox/flox的小鼠胚胎成纖維細胞,進行體外培養(yǎng)、傳代,并凍存細胞。將腺病毒表達質粒YFP-Cre和包膜質粒10A1共轉染入人腎上皮細胞系293t細胞,包裝出腺病毒,使用病毒液感染制備好的基因型為Snf5flox/flox的小鼠胚胎成纖維細胞。流式篩選出Snf5-/-細胞,利用EBSS培養(yǎng)液對細胞進行饑餓處理,Western Blot實驗檢測細胞中自噬標記LC3-I、LC3-II表達量變化,檢測自噬水平變化。第二部分:利用已有的小鼠胚胎成纖維細胞中敲除Snf5基因后的基因表達譜芯片數(shù)據(jù),進行基因集富集分析。選取Snf5缺失的BT12、G401惡性橫紋肌樣瘤MRT(malignant rhabdoid tumor)細胞系,以Hela子宮頸癌細胞系作為對照,分別使用EBSS培養(yǎng)液對細胞進行梯度時間饑餓處理,Western Blot實驗檢測細胞中LC3-I、LC3-II表達量變化,檢測自噬水平變化。使用Ezh2小分子抑制劑EPZ6438,分別以一定的濃度梯度處理Snf5缺失的A204、G401細胞,Western Blot實驗檢測H3K27me3水平和LC3-I、LC3-II表達量變化,檢測自噬水平變化。結果:第一部分:利用Cre-loxP系統(tǒng),將包裝好的表達Cre酶的腺病毒感染Snf5flox/flox小鼠胚胎成纖維細胞,流式細胞術篩選出Snf5-/-小鼠胚胎成纖維細胞,使用EBSS進行梯度時間饑餓處理后,Western Blot實驗結果顯示Snf5-/-小鼠胚胎成纖維細胞在饑餓處理0h時LC3-II水平就明顯升高,提示在小鼠胚胎成纖維細胞中敲除Snf5可能誘導了細胞自噬的發(fā)生。第二部分:基因富集分析的結果顯示,在敲除了Snf5小鼠胚胎成纖維細胞基因表達變化的排序中,成視網(wǎng)膜細胞瘤基因RB下游相關基因的基因集在頂端發(fā)生明顯富集,而轉錄因子E2F的靶基因與自噬調(diào)控相關,揭示可能Snf5缺失引起的RB/E2F信號通路異常影響了自噬。使用EBSS培養(yǎng)液對Hela、BT12、G401細胞系進行梯度時間饑餓處理,Western Blot實驗結果顯示,Hela細胞中LC3-II的水平無明顯變化,而Snf5缺失的BT12、G401細胞中LC3-II水平在饑餓1h時就明顯升高,揭示誘導自噬發(fā)生。EPZ6438是一種Ezh2小分子抑制劑,能夠通過抑制Ezh2活性而降低H3K27me3的水平。Western Blot實驗結果顯示,使用EPZ6438處理A204、G401惡性橫紋肌樣瘤細胞系時,均在抑制劑濃度為10μM,處理96h后,H3K27me3水平明顯降低,同時LC3-II的水平明顯升高,揭示誘導自噬發(fā)生。結論:1、小鼠胚胎成纖維細胞的自噬可能是受Snf5調(diào)控的。敲除Snf5基因后,小鼠胚胎成纖維細胞自噬水平明顯升高。2、在敲除了Snf5小鼠胚胎成纖維細胞基因表達譜變化排序中,并未發(fā)現(xiàn)自噬相關基因集在其頂部或底部富集,而結果顯示,成視網(wǎng)膜細胞瘤基因RB下游相關基因的基因集在其頂部明顯富集,揭示可能Snf5缺失引起的RB/E2F信號通路異常影響了自噬。3、饑餓誘導自噬,相較于子宮頸癌Hela細胞系,Snf5缺失的惡性橫紋肌樣瘤A204、G401細胞系具有較高敏感度的自噬活性,揭示干預MRT細胞自噬可能會發(fā)現(xiàn)新的治療方向。4、在Snf5缺失的MRT細胞中,EPZ6438可以通過抑制Ezh2酶活性降低H3K27me3水平,使LC3-II表達水平增高,誘導自噬發(fā)生。揭示Ezh2催化的H3K27me3可能參與調(diào)節(jié)自噬,將Ezh2作為藥物靶點并聯(lián)合使用調(diào)控自噬類藥物,可能會加強對MRT細胞的殺傷作用。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R738.7

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本文編號：1181144