本文關(guān)鍵詞：人參皂苷Rh2通過激活Gsk-3β削弱β-catenin在肝癌HepG2細(xì)胞的增殖作用

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【摘要】：肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,易于肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及向肺、骨、腎、腦轉(zhuǎn)移。對(duì)廣大肝癌患來說,手術(shù)切除是最有效的治療方法,但5年生存率12%。隨著介入治療的發(fā)展,使得化療藥物可以直接作用于肝癌細(xì)胞,部分患者的壽命得以延長(zhǎng)。然而,有的肝癌患者對(duì)化療不敏感,容易產(chǎn)生耐藥,對(duì)于這部分患者來說,目前尚缺乏有效的治療方法。因此,尋求有效的藥物來提高化學(xué)療法的效果是目前研究的焦點(diǎn)。人參是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥,在腫瘤的治療方面具有很高的藥用價(jià)值,人參皂苷(ginsenoside)是其主要藥用成分。大量研究表明人參皂甙Rh2可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞的凋亡。在我們的實(shí)驗(yàn)研究中也發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rh2可抑制HepG2肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其調(diào)亡,且呈濃度和時(shí)間依賴。但其具體的作用機(jī)制是什么卻尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。Wnt信號(hào)通路的異常激活同多種惡性腫瘤如結(jié)、直腸癌,肝癌,乳腺癌,前列腺癌等有關(guān)。β-catenin作為Wnt通路中重要的信號(hào)傳遞因子參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織,同時(shí)β-catenin對(duì)抗癌藥物有抵抗作用。β-catenin在正常組織及癌組織中作為一個(gè)重要的分子,它的穩(wěn)定性依賴于由Axin、APC和GSK-3p構(gòu)成的降解復(fù)合物,β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平主要由GSK-3p去調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中GSK-3p蛋白的表達(dá)水平明顯低于正常肝組織及癌旁組織,而且低表達(dá)的GSK-3p臨床病理特征預(yù)示著預(yù)后不良。故GSK-3p可作為一個(gè)潛在抗癌的靶點(diǎn)。我們實(shí)驗(yàn)室劉等研究發(fā)現(xiàn)TSPG和Rh2可抑制KG1 α細(xì)胞增殖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且發(fā)現(xiàn)經(jīng)TSPG和Rh2作用后,KGla細(xì)胞胞核中的β-catenin蛋白明顯減少,其表達(dá)區(qū)域由胞核向胞膜轉(zhuǎn)移。在肝癌細(xì)胞中Rh2是否有類似的作用?而過表達(dá)β-catenin是否可以削弱Rh2這一的藥理作用呢?Rh2使KGla細(xì)胞胞核中的β-catenin蛋白減少,這與GSK-3β是否有關(guān)?因此,我們假設(shè)Rh2抗癌的作用可能是激活了GSK-3β的活性從而降解β-catenin 。我們首先檢測(cè)Rh2對(duì)HepG2細(xì)胞的藥理作用,然后構(gòu)建了過表達(dá)P-catenin的慢病毒質(zhì)粒感染HepG2田胞,檢驗(yàn)過表達(dá)的P-catenin能否削弱Rh2對(duì)HepG2細(xì)胞的藥理作用；再用GSK-3β的抑制劑Bio ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime,糖原合酶激酶-3 β抑制劑)來驗(yàn)證Rh2是否激活了G SK-3β;用PCR.CHIP、WB檢測(cè)β-catenin下游基因的變化,進(jìn)一步證實(shí)Rh2對(duì)HepG2細(xì)胞的藥理作用可能是通過激活了GSK-3β的活性從而降解β-cateni n來實(shí)現(xiàn)的。方法第一部分構(gòu)建pLOV-EFla-MCS-3FLAG-β-catenin'慢病毒去感染HepG2細(xì)胞,運(yùn)用熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度,采用FCM檢測(cè)感染率,用PCR方法檢測(cè)β-catenin基因表達(dá)。第二部分通過CCK-8法檢測(cè)人參皂苷Rh2對(duì)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞的作用。采用FCM檢測(cè)人參皂苷Rh2對(duì)HepG2細(xì)胞HepG2-β-catenin細(xì)胞周期及凋亡的影響；第三部分利用ELISA檢測(cè)人參皂苷Rh2對(duì)Gsk-3p活性的影響,同時(shí)我們加入了GSK-3β的抑制Bio；用PCR檢測(cè)Gsk-3β、β-catenin, CycliD1、Bax、MMP3基因的表達(dá)；用CHIP檢測(cè)Bcl2、CycliD1、Bax. MMP3基因的表達(dá)；運(yùn)用Western Blots檢測(cè)Gsk-3β、p-catenin、Bcl2、 CycliD1、Bax、MMP3蛋白的表達(dá)。第四部分分別用HepG2、HepG2-β-catenin細(xì)胞接種到4周齡的Balb/c裸小鼠臀部,荷瘤直徑約0.5cm后采用灌胃針灌入Rh2 (20mg/Kg),每天測(cè)瘤的直徑及小鼠體重,灌胃20天后處死,測(cè)瘤的體重、直徑,用HE染色觀察細(xì)胞的形態(tài)；用免疫組化檢測(cè)Gsk-3β、β-catenin. MMP3;利用ELISA檢測(cè)人參皂苷Rh2對(duì)Gsk-3β活性的影響；用PCR檢測(cè)Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CycliD1、Bax、MMP3基因的表達(dá)；用Western Blot檢測(cè)Gsk-3β、β-catenin蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 用 pLOV-EF 1 a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒去感染HepG2細(xì)胞,感染成功的HepG2細(xì)胞命名為HepG2-β-catenin。用PCR檢測(cè),HepG2-β-catenin 鍘 P-catenin基因的表達(dá)明顯高于HepG2組。2.CCK-8結(jié)果顯示：Rh2在體外能有效抑制HepG2及HepG2-β-catenin細(xì)胞增殖,HepG2-β-catenin細(xì)胞的Rh2ic50濃度較HepG2細(xì)胞高。3.FCM檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示：Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞均可使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期；HepG2組G0/G1期(61.02+1.48)%,HepG2+Rh2組(64.57+0.65)%HepG2-β-catenin組(52.86+1.46)%,HepG2-β-catenin+Rh2組(58.61±2.01)%。與HepG2組相比,HepG2-p-catenin組細(xì)胞的GO/G1期(52.86±1.46)%明顯低于HepG2組(61.02±1.48)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示: Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-p-catenin細(xì)胞早期凋亡。HepG2組凋亡率(10.01±2.02)%,HepG2+Rh2組凋亡率(17.27±2.77)%, HepG2-β-catenin組凋亡率(5.26±0.50)%HepG2-β-catenin+Rh2組凋亡率(9.02±1.76)%,HepG2-β-catenin+Rh2組凋亡率低于HepG2+Rh2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。5. ELISA結(jié)果顯示:Rh2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞12、24、48、72h后,Gsk-3p的活性隨著時(shí)間延長(zhǎng),逐漸升高,在48小時(shí)最高,隨后其活性開始降低。Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞48小時(shí),與對(duì)照組相比,Gsk-3β的活性均增高,而加入Bio后其活性降低。6. PCR、CHIP、WB結(jié)果顯示： 人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞后,Gsk-3β、Bax基因及蛋白表達(dá)增加,而β-catenin、CycliD1、 Bcl2、MMP3基因及蛋白表達(dá)水平下調(diào)。與HepG2-β-catenin+Rh2組相比,HepG2+Rh2組除Gsk-3β外各基因及蛋白的表達(dá)變化更為顯著,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。7.構(gòu)建肝癌動(dòng)物模型結(jié)果顯示：HepG2荷瘤組的瘤重(1.6±0.16)g,HepG2+Rh2荷瘤組(1.0±0.13)g; HepG2-β-catenin荷瘤組(1.7±0.19) g, HepG2-β-catenin+Rh2荷瘤組(1.10±0.12) g, HepG2-β-catenin荷瘤組(1.7+0.19)g瘤重大于HepG2荷瘤組(1.6±0.16)g,HepG2-β-catenin+Rh2荷瘤組(1.10±0.12)g瘤重大于HepG2+Rh2荷瘤組(1.0±0.13)g,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。8.HE染色結(jié)果顯示：HepG2荷瘤組和HepG2-β-catenin荷瘤組中細(xì)胞核成異型性,占整個(gè)細(xì)胞比例大,但HepG2-β-catenin荷瘤組更明顯。HepG2-p-catenin+Rh2荷瘤組和HepG2+Rh2荷瘤組中細(xì)胞胞核固縮,及大量破碎細(xì)胞,而HepG2+Rh2荷瘤組細(xì)胞胞核固縮及破碎細(xì)胞更明顯。9.免疫組化結(jié)果顯示：人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HepG2 及 HepG2-β-catenin細(xì)胞,Gsk-3β表達(dá)增強(qiáng),β-catenin、MMP3表達(dá)降低。HepG2+Rh2組中P-catenin、MMP3表達(dá)弱于HepG2-β-catenin+Rh2組,而Gsk-3β表達(dá)則無明顯差異。10.ELISA結(jié)果顯示：人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HepG2腫瘤及HepG2-β-catenin腫瘤后Gsk-3β的活性均升高。11.PCR結(jié)果顯示：人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HepG2荷瘤組及HepG2-β-catenin荷瘤組后,Gsk-3p、Bax基因增強(qiáng),β-catenin、CycliD1、 Bcl2、MMP3表達(dá)降低。但HepG2+Rh2組中β-catenin、CycliD 1、Bcl2表達(dá)弱于HepG2-β-catenin+Rh2組,Bax基因表達(dá)增強(qiáng),而Gsk-3β表達(dá)無明顯差異。12. Western B lot結(jié)果顯示：人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HepG2荷瘤組及HepG2-β-catenin荷瘤組后,Gsk-3β蛋白增強(qiáng),β-catenin表達(dá)降低。但HepG2+Rh2組中β-catenin表達(dá)弱于HepG2-p-catenin+Rh2組,而Gsk-3β表達(dá)無明顯差異。結(jié)論：1.過表達(dá)的β-catenin可削弱人參皂苷Rh2對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的藥理作用。2.人參皂苷Rh2通過激活Gsk-3β降解β-catenin,影響下游基因的表達(dá),促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡及抑制其轉(zhuǎn)移。3.體內(nèi)試驗(yàn)表明,Rh2對(duì)肝癌瘤重的抑制作用是通過激活Gsk-3β降解β-catenin而實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1180927