本文關鍵詞：人參皂苷Rh2通過激活Gsk-3β削弱β-catenin在肝癌HepG2細胞的增殖作用

  更多相關文章： 人參皂苷Rh2 HepG2 Gsk-3β β-catenin

【摘要】：肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,易于肝內(nèi)轉移及向肺、骨、腎、腦轉移。對廣大肝癌患來說,手術切除是最有效的治療方法,但5年生存率12%。隨著介入治療的發(fā)展,使得化療藥物可以直接作用于肝癌細胞,部分患者的壽命得以延長。然而,有的肝癌患者對化療不敏感,容易產(chǎn)生耐藥,對于這部分患者來說,目前尚缺乏有效的治療方法。因此,尋求有效的藥物來提高化學療法的效果是目前研究的焦點。人參是我國傳統(tǒng)中草藥,在腫瘤的治療方面具有很高的藥用價值,人參皂苷(ginsenoside)是其主要藥用成分。大量研究表明人參皂甙Rh2可誘導胰腺癌細胞、肝癌細胞和A549肺癌細胞的凋亡。在我們的實驗研究中也發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rh2可抑制HepG2肝癌細胞的增殖并誘導其調亡,且呈濃度和時間依賴。但其具體的作用機制是什么卻尚未有文獻報道。Wnt信號通路的異常激活同多種惡性腫瘤如結、直腸癌,肝癌,乳腺癌,前列腺癌等有關。β-catenin作為Wnt通路中重要的信號傳遞因子參與調節(jié)細胞的生長和增殖,研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中β-catenin蛋白的表達水平明顯高于癌旁組織,同時β-catenin對抗癌藥物有抵抗作用。β-catenin在正常組織及癌組織中作為一個重要的分子,它的穩(wěn)定性依賴于由Axin、APC和GSK-3p構成的降解復合物,β-catenin在細胞內(nèi)的表達水平主要由GSK-3p去調節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中GSK-3p蛋白的表達水平明顯低于正常肝組織及癌旁組織,而且低表達的GSK-3p臨床病理特征預示著預后不良。故GSK-3p可作為一個潛在抗癌的靶點。我們實驗室劉等研究發(fā)現(xiàn)TSPG和Rh2可抑制KG1 α細胞增殖誘導細胞凋亡,且發(fā)現(xiàn)經(jīng)TSPG和Rh2作用后,KGla細胞胞核中的β-catenin蛋白明顯減少,其表達區(qū)域由胞核向胞膜轉移。在肝癌細胞中Rh2是否有類似的作用?而過表達β-catenin是否可以削弱Rh2這一的藥理作用呢?Rh2使KGla細胞胞核中的β-catenin蛋白減少,這與GSK-3β是否有關?因此,我們假設Rh2抗癌的作用可能是激活了GSK-3β的活性從而降解β-catenin 。我們首先檢測Rh2對HepG2細胞的藥理作用,然后構建了過表達P-catenin的慢病毒質粒感染HepG2田胞,檢驗過表達的P-catenin能否削弱Rh2對HepG2細胞的藥理作用；再用GSK-3β的抑制劑Bio ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime,糖原合酶激酶-3 β抑制劑)來驗證Rh2是否激活了G SK-3β;用PCR.CHIP、WB檢測β-catenin下游基因的變化,進一步證實Rh2對HepG2細胞的藥理作用可能是通過激活了GSK-3β的活性從而降解β-cateni n來實現(xiàn)的。方法第一部分構建pLOV-EFla-MCS-3FLAG-β-catenin'慢病毒去感染HepG2細胞,運用熒光顯微鏡觀察熒光強度,采用FCM檢測感染率,用PCR方法檢測β-catenin基因表達。第二部分通過CCK-8法檢測人參皂苷Rh2對HepG2和HepG2-β-catenin細胞的作用。采用FCM檢測人參皂苷Rh2對HepG2細胞HepG2-β-catenin細胞周期及凋亡的影響；第三部分利用ELISA檢測人參皂苷Rh2對Gsk-3p活性的影響,同時我們加入了GSK-3β的抑制Bio；用PCR檢測Gsk-3β、β-catenin, CycliD1、Bax、MMP3基因的表達；用CHIP檢測Bcl2、CycliD1、Bax. MMP3基因的表達；運用Western Blots檢測Gsk-3β、p-catenin、Bcl2、 CycliD1、Bax、MMP3蛋白的表達。第四部分分別用HepG2、HepG2-β-catenin細胞接種到4周齡的Balb/c裸小鼠臀部,荷瘤直徑約0.5cm后采用灌胃針灌入Rh2 (20mg/Kg),每天測瘤的直徑及小鼠體重,灌胃20天后處死,測瘤的體重、直徑,用HE染色觀察細胞的形態(tài)；用免疫組化檢測Gsk-3β、β-catenin. MMP3;利用ELISA檢測人參皂苷Rh2對Gsk-3β活性的影響；用PCR檢測Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CycliD1、Bax、MMP3基因的表達；用Western Blot檢測Gsk-3β、β-catenin蛋白的表達。實驗結果1. 用 pLOV-EF 1 a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒去感染HepG2細胞,感染成功的HepG2細胞命名為HepG2-β-catenin。用PCR檢測,HepG2-β-catenin 鍘 P-catenin基因的表達明顯高于HepG2組。2.CCK-8結果顯示：Rh2在體外能有效抑制HepG2及HepG2-β-catenin細胞增殖,HepG2-β-catenin細胞的Rh2ic50濃度較HepG2細胞高。3.FCM檢測細胞周期結果顯示：Rh2誘導HepG2和HepG2-β-catenin細胞均可使細胞周期阻滯在G0/G1期；HepG2組G0/G1期(61.02+1.48)%,HepG2+Rh2組(64.57+0.65)%HepG2-β-catenin組(52.86+1.46)%,HepG2-β-catenin+Rh2組(58.61±2.01)%。與HepG2組相比,HepG2-p-catenin組細胞的GO/G1期(52.86±1.46)%明顯低于HepG2組(61.02±1.48)%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4.FCM檢測細胞凋亡結果顯示: Rh2誘導HepG2和HepG2-p-catenin細胞早期凋亡。HepG2組凋亡率(10.01±2.02)%,HepG2+Rh2組凋亡率(17.27±2.77)%, HepG2-β-catenin組凋亡率(5.26±0.50)%HepG2-β-catenin+Rh2組凋亡率(9.02±1.76)%,HepG2-β-catenin+Rh2組凋亡率低于HepG2+Rh2組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。5. ELISA結果顯示:Rh2誘導HepG2細胞12、24、48、72h后,Gsk-3p的活性隨著時間延長,逐漸升高,在48小時最高,隨后其活性開始降低。Rh2誘導HepG2和HepG2-β-catenin細胞48小時,與對照組相比,Gsk-3β的活性均增高,而加入Bio后其活性降低。6. PCR、CHIP、WB結果顯示： 人參皂苷Rh2誘導HepG2和HepG2-β-catenin細胞后,Gsk-3β、Bax基因及蛋白表達增加,而β-catenin、CycliD1、 Bcl2、MMP3基因及蛋白表達水平下調。與HepG2-β-catenin+Rh2組相比,HepG2+Rh2組除Gsk-3β外各基因及蛋白的表達變化更為顯著,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。7.構建肝癌動物模型結果顯示：HepG2荷瘤組的瘤重(1.6±0.16)g,HepG2+Rh2荷瘤組(1.0±0.13)g; HepG2-β-catenin荷瘤組(1.7±0.19) g, HepG2-β-catenin+Rh2荷瘤組(1.10±0.12) g, HepG2-β-catenin荷瘤組(1.7+0.19)g瘤重大于HepG2荷瘤組(1.6±0.16)g,HepG2-β-catenin+Rh2荷瘤組(1.10±0.12)g瘤重大于HepG2+Rh2荷瘤組(1.0±0.13)g,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。8.HE染色結果顯示：HepG2荷瘤組和HepG2-β-catenin荷瘤組中細胞核成異型性,占整個細胞比例大,但HepG2-β-catenin荷瘤組更明顯。HepG2-p-catenin+Rh2荷瘤組和HepG2+Rh2荷瘤組中細胞胞核固縮,及大量破碎細胞,而HepG2+Rh2荷瘤組細胞胞核固縮及破碎細胞更明顯。9.免疫組化結果顯示：人參皂苷Rh2誘導HepG2 及 HepG2-β-catenin細胞,Gsk-3β表達增強,β-catenin、MMP3表達降低。HepG2+Rh2組中P-catenin、MMP3表達弱于HepG2-β-catenin+Rh2組,而Gsk-3β表達則無明顯差異。10.ELISA結果顯示：人參皂苷Rh2誘導HepG2腫瘤及HepG2-β-catenin腫瘤后Gsk-3β的活性均升高。11.PCR結果顯示：人參皂苷Rh2誘導HepG2荷瘤組及HepG2-β-catenin荷瘤組后,Gsk-3p、Bax基因增強,β-catenin、CycliD1、 Bcl2、MMP3表達降低。但HepG2+Rh2組中β-catenin、CycliD 1、Bcl2表達弱于HepG2-β-catenin+Rh2組,Bax基因表達增強,而Gsk-3β表達無明顯差異。12. Western B lot結果顯示：人參皂苷Rh2誘導HepG2荷瘤組及HepG2-β-catenin荷瘤組后,Gsk-3β蛋白增強,β-catenin表達降低。但HepG2+Rh2組中β-catenin表達弱于HepG2-p-catenin+Rh2組,而Gsk-3β表達無明顯差異。結論：1.過表達的β-catenin可削弱人參皂苷Rh2對肝癌HepG2細胞的藥理作用。2.人參皂苷Rh2通過激活Gsk-3β降解β-catenin,影響下游基因的表達,促進肝癌細胞的凋亡及抑制其轉移。3.體內(nèi)試驗表明,Rh2對肝癌瘤重的抑制作用是通過激活Gsk-3β降解β-catenin而實現(xiàn)的。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 丁志山，，沃興德;細胞調亡與動脈粥樣硬化[J];中國動脈硬化雜志;1998年01期

2 李妍;紀朋艷;張巍;彭順利;呂士杰;;柴胡皂苷d對SH-SY5Y細胞ERK蛋白表達及凋亡的影響[J];中國醫(yī)科大學學報;2013年12期

3 嚴銀芳,陳曉,楊小清,閆遠芳;流行性腮腺炎病毒減毒株S_(79)在幾株腫瘤細胞和正常細胞中增殖的比較研究[J];腫瘤;2003年06期

4 劉功讓;管培中;宋淑亮;逯素梅;馮玉新;辛華;;絞股藍多糖對四氯化碳損傷HepG2細胞的保護作用[J];山東醫(yī)藥;2007年31期

5 肖東杰,汪運山;B細胞被動凋亡的研究進展[J];國外醫(yī)學(臨床生物化學與檢驗學分冊);1998年05期

6 張運濤,劉凡,姜茹,谷仲平,汪涌,張順,劉榮福,李玉梅;外源性p27與GRC-1細胞端粒酶活性及細胞凋亡關系的實驗研究[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2002年09期

7 石和元;王平;胡永年;邱幸凡;田代志;;溫膽湯改良方對Aβ_(25-35)誘導AD細胞模型bcl-2、bax蛋白表達的影響[J];世界科學技術;2005年06期

8 孟威宏;王強;王虹蛟;顏煒群;;牛胰蛋白酶抑制劑研究進展[J];國外醫(yī)學(老年醫(yī)學分冊);2008年04期

9 鐘民濤;王曉麗;李星云;劉磊;劉穎麗;張偉;黃敏;;香菇C91-3菌絲發(fā)酵蛋白對H22腫瘤細胞體內(nèi)外抗腫瘤機制的初探[J];中國微生態(tài)學雜志;2011年09期

10 張晨,黃世林,馬東初,孫英慧,馬小鋒;硫化砷誘導NB_4細胞調亡[J];白血病;2000年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄒萍;;血液系統(tǒng)惡性腫瘤細胞來源膜微粒的特征及生物學作用研究[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

2 蔣爭凡;卞婕;翟中和;;非細胞體系誘導小鼠肝細胞核凋亡的超微觀察[A];第十次全國電子顯微學會議論文集（Ⅰ）[C];1998年

3 陳衛(wèi)銀;祝彼得;劉福友;馮雪梅;;參芎滴丸對急性腦梗死模型大鼠神經(jīng)細胞調亡的影響[A];中華醫(yī)學會第十三次全國神經(jīng)病學學術會議論文匯編[C];2010年

4 謝晶日;李威;梁國英;楊豐源;;胃靈顆粒對胃癌前病變細胞調亡基因影響的實驗研究[A];中華中醫(yī)藥學會脾胃病分會第十八次學術交流會論文匯編[C];2006年

5 綦淑芬;萬瑞香;姚如勇;;扇貝多肽對Hela細胞在紫外線損傷下的保護作用[A];第五屆全國自由基生物學與自由基醫(yī)學學術討論會論文摘要匯編[C];2000年

6 吳李君;裴蓓;王順昌;王軍;湯明禮;;砷和鎘暴露誘導秀麗小桿線蟲生殖腺細胞調亡及其信號通路研究[A];中國毒理學會第二屆全國中青年學者科技論壇會議論文集[C];2007年

7 余珂;王敬賢;周炳升;;多溴聯(lián)苯醚誘導人神經(jīng)SK-N-SH細胞調亡的機理[A];湖北省暨武漢市生物化學與分子生物學學會第八屆第十七次學術年會論文匯編[C];2007年

8 冉新澤;鄭懷恩;王艾平;王鋒超;韓京;;他汀對內(nèi)皮細胞輻射損傷組織因子與細胞調亡的影響[A];中國毒理學會放射毒理專業(yè)委員會第七次、中國毒理學會免疫毒理專業(yè)委員會第五次、中國環(huán)境誘變劑學會致突專業(yè)委員會第二次、中國環(huán)境誘變劑學會致畸專業(yè)委員會第二次、中國環(huán)境誘變劑學會致癌專業(yè)委員會第二次全國學術會議論文匯編[C];2008年

9 崔承彬;閆少羽;蔡兵;趙慶春;姚新生;曲戈霞;;黑果黃皮Clausena dunniana Levl中咔唑生物堿類新細胞周期抑制劑及細胞調亡誘導劑的核磁共振研究[A];第十一屆全國波譜學學術會議論文摘要集[C];2000年

10 吳耀輝;鄒萍;;Sunrivin基因沉默對K562細胞調亡影響的研究[A];第11次中國實驗血液學會議論文匯編[C];2007年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張?zhí)锟?細胞調亡的意義[N];中國人口報;2002年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 羅曉明;載藥聚合物超細纖維作為腫瘤局部制劑的研究[D];西南交通大學;2014年

2 王石;黃芪甲苷促進血管新生的分子機制研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2013年

3 宋楊;抗CD25單抗對腎移植患者調節(jié)性T細胞生存和功能改變影響的研究[D];復旦大學;2014年

4 羅忠光;CRL E3泛素連接酶靶向新藥MLN4924在體內(nèi)外殺傷肝癌細胞的作用及機制研究[D];復旦大學;2014年

5 肖林林;巨噬細胞對血管細胞的輻射旁效應及其分子機制研究[D];復旦大學;2014年

6 張峰;戊型肝炎病毒基因4型在PLC/PRF/5細胞中的培養(yǎng)及其特征研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2014年

7 陳鳳華;Tat-SmacN7融合肽對腫瘤細胞輻射增敏作用的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2013年

8 虞志新;Th17/Treg失衡及其與中性粒細胞相互影響在ARDS發(fā)病中的作用和機制研究[D];江蘇大學;2015年

9 黃凌燕;STK33基因在下咽鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究[D];山東大學;2015年

10 袁媛;let-7c介導c-Myc基因調控逆轉肝癌細胞多藥耐藥的機制研究[D];蘭州大學;2015年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王帥帥;Marc-145細胞中豬繁殖與呼吸綜合癥病毒粒子與胞外體的分離與鑒定[D];山西農(nóng)業(yè)大學;2015年

2 杜文娟;NK-lysin通過Wnt/β-catenin信號通路抑制肝癌細胞侵襲與轉移的研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 張曉嬌;天然抗氧化劑對乳腺癌MCF-7/ADM細胞的耐藥逆轉作用及機制研究[D];河北聯(lián)合大學;2014年

4 呂超紹;重組人干擾素γ(rhIFN-γ)對白血病K562細胞免疫逃逸的影響[D];昆明理工大學;2015年

5 汪建陽;Ang-(1-7)通過G蛋白偶聯(lián)受體Mas對人肝癌HepG2細胞的影響研究[D];廣西醫(yī)科大學;2015年

6 任志濤;小檗堿對TGF-β1誘導A549細胞上皮間質轉化和MRC-5細胞轉分化及細胞信號通路相關蛋白的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

7 楊曉姍;重組人p66Shc腺病毒和賴氨藤黃酸鹽對腫瘤細胞的抑制作用及機制[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

8 萬愛英;大分割照射生物效應實測數(shù)據(jù)與LQ公式計算數(shù)據(jù)的比較研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

9 邢曉萌;白藜蘆醇對肺癌A549細胞的放射增敏作用及其機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

10 曹曰針;胞外泛素對Treg細胞免疫抑制活性的影響[D];復旦大學;2014年

本文編號：1180927