本文關(guān)鍵詞：EMT在非小細胞肺癌EGFR-TKIs獲得性耐藥中的作用及機制研究

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【摘要】：研究背景和目的肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,已經(jīng)成為癌癥病人死亡的最常見原因。近年來,分子靶向治療成為研究熱點并運用于臨床,以吉非替尼為代表的表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)已經(jīng)用于EGFR (epidermal growth factor receptor,EGFR)突變型晚期NSCLC的一線、二線治療,對EGFR野生型NSCLC的有效率也達到5%-6%,然而耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)成為制約EGFR-TKIs進一步應(yīng)用的瓶頸,使使用EGFR-TKIs治療的患者的中位無進展時間僅為8～10個月。因此,研究和發(fā)現(xiàn)EGFR-TKIs獲得性耐藥機制,積極尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的新方法具重要的臨床意義。目前認為,EGFR突變型NSCLC細胞對EGFR-TKIs獲得性耐藥的主要相關(guān)機制為EGFR基因的二次突變(20外顯子T790M突變)及Met基因的擴增,二者所占比例分別為50%和20%左右,其中約10%重疊,故這兩種機制覆蓋了約60%的EGFR-TKIs獲得性耐藥[3-7]。但仍有約40%的EGFR突變型NSCLC的獲得性耐藥機制以及EGFR野生型NSCLC的獲得性耐藥機制尚未明確,其中可能包括EGFR以外的酪氨酸激酶受體(如IGF-1R等)信號傳導(dǎo)通路的激活、EGFR下游信號通路中的分子異�；罨�、肝細胞生長因子(HGF)過表達、蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)的缺失、EML4-ALK融合基因及細胞EMT的發(fā)生等。本課題組的前期研究已證實,EGFR野生型的NSCLC細胞H460在EGFR-TKIs獲得性耐藥過程中發(fā)生了EMT,提示EMT可能在EGFR野生型NSCLC獲得性耐藥過程中起重要作用。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial- mesenchymal transi ion,EMT),是上皮細胞失去上皮特性,獲得間質(zhì)細胞表型的一種生物現(xiàn)象,發(fā)生EMT后,細胞E-鈣黏蛋白、角蛋白等上皮標記基因表達降低,波形蛋白、纖維連接素、N-鈣黏蛋白等間質(zhì)標記基因表達升高。EMT與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移、藥物耐藥有密切關(guān)系,且與NSCLC的預(yù)后及對EGFR-TKIs敏感性密切相關(guān)[13-16]。Thomson等]對EGFR野生型NSCLC細胞的研究顯示,表達E-cadherin/beta-catenin的NSCLC細胞對EGFR-TKIs敏感,而表達vimentin/fibronectin的NSCLC細胞則對EGFR-TKIs不敏感。Rho等通過建立吉非替尼耐藥肺癌細胞亞株(A549/GR),對比A549細胞株,A549/GR細胞株對吉非替尼的耐藥性為A549細胞株的7.7倍；進一步發(fā)現(xiàn),A549/GR細胞表現(xiàn)出EMT表型特點。厄洛替尼耐藥的非小細胞肺癌細胞株H460和Calu6上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達降低,而厄洛替尼敏感細胞株H292的E-cadherin則呈現(xiàn)高表達。吉非替尼耐藥的肺癌細胞株H157、H1730、A549、H520上皮細胞標志蛋白E-cadherin、上皮細胞粘附分子EpCAM、緊密連接體蛋白claudin4和caludin7的表達普遍較低,而吉非替尼敏感細胞株H322、H358、H1648這些蛋白表達則增高[19-21]。Yauch等的研究發(fā)現(xiàn),不論在EGRF野生型還是EGFR突變型的NSCLC細胞,E-cadherin表達均與細胞對EGFR-TKIs敏感性密切相關(guān)。用基因轉(zhuǎn)染增加E-cadherin表達可提高腫瘤細胞對EGFR-TKIs治療的敏感性。與基礎(chǔ)研究結(jié)果一致,E-cadherin表達水平可作為預(yù)測NSCLC患者對EGFR-TKIs臨床療效的一個新的生物學(xué)標記。一項觀察EGFR-TKIs聯(lián)合化療治療NSCLC的國際多中心隨即III期臨床研究結(jié)果顯示：E-cadherin表達陽性的患者疾病進展時間明顯延長。吉非替尼一線治療NSCLC, E-cadherin表達陽性的患者總生存顯著長于E-cadherin表達陰性的患者。多種轉(zhuǎn)錄因子密切參與了EMT的發(fā)生,目前發(fā)現(xiàn)Snail、Slug、Twist、 ZEB1、Smad、NF-B等。研究發(fā)現(xiàn),EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(ZEB1、slug)在吉非替尼獲得性耐藥的過程中也起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用,靶向消除Slug的表達能逆轉(zhuǎn)耐藥細胞株的間質(zhì)化特征,恢復(fù)耐藥細胞株對吉非替尼的敏感性。對于NSCLC細胞發(fā)生EMT后EGFR-TKIs治療敏感性下降的分子細胞學(xué)機制目前尚未闡明。有研究顯示,EMT可能降低了腫瘤細胞生長或增值對EGFR信號通路的依賴性,間質(zhì)表型細胞可產(chǎn)生持續(xù)的Akt激活,引發(fā)了非EGFR依賴性PI3K/Akt信號通路激活,從而導(dǎo)致了腫瘤細胞對厄洛替尼等EGFR-TKIs治療的不敏感。目前,關(guān)于EMT參與NSCLC細胞EGFR-TKIs獲得性耐藥的具體作用機制有待進一步深入研究闡明。因此,在課題組前期工作的基礎(chǔ)上,本課題擬通過構(gòu)建靶向CDH1基因的過表達慢病毒表達載體感染EGFR野生型和突變型NSCLC細胞,提高E-cadherin的表達水平,逆轉(zhuǎn)細胞的EMT,觀察耐藥細胞對EGFR-TKIs的敏感性變化,探討EMT在NSCLC細胞對EGFR-TKIs產(chǎn)生獲得性耐藥中的作用及其可能的分子學(xué)機制,為提高EGFR-TKIs療效尋找新靶點和新方法。方法1、選用EGFR突變型的人肺腺癌細胞PC/9及其吉非替尼耐藥細胞PC9/AB。高分辨率溶解曲線分析技術(shù)(Quantitative PCR high-resolution melting, qPCR-HRM)檢測PC9/AB細胞EGFR及Kras基因突變；MTT法檢測兩組組細胞的增殖情況；劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的改變；Western blot方法檢測兩組細胞的EGFR、p-EGFR、E-cadherin. Vimentin、Snail等的蛋白水平的表達變化。2、利用GV218質(zhì)粒構(gòu)建靶向CDH1 (NM-004360) (E-cadherin基因)的過表達載體和陰性對照載體,并用PCR電泳鑒定和基因測序；經(jīng)過鑒定測序的構(gòu)建好的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞,用Western Blot外源篩選有效過表達載體；選擇轉(zhuǎn)染效果良好的慢病毒載體進行包裝并測定滴度；慢病毒感染目的細胞H460/ER和PC9/AB,并確定轉(zhuǎn)染效率；用實時熒光定量PCR和Western Blot法分別從mRNA水平和蛋白水平檢測對目的基因CDH1的過表達效應(yīng)。3、CDH1基因穩(wěn)定過表達后,觀察細胞的形態(tài)變化,劃痕實驗和Transwell實驗檢測H460/ER、PC9/AB細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的改變；Western Blot檢測H460/ER、PC9/AB細胞E-cadherin、Vimentin、Snail的表達變化。4 CDH1基因穩(wěn)定過表達后,MTT法測H460/ER、PC9/AB對的增殖情況變化,Western blot方法檢測EGFR及其磷酸化蛋白的表達變化。5、統(tǒng)計方法采用SPSS13.0軟件進統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果數(shù)據(jù)以X±s表示。兩組間比較采用t檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1、PC9/AB細胞和H460/ER細胞的EGFR和K-ras基因突變狀況基因突變檢測結(jié)果顯示,PC9/AB細胞為EGFR基因19號外顯子缺失突變型及K-ras基因野生型,無T790M突變及cMET基因擴增。前期研究結(jié)果顯示,H460/ER細胞為EGFR基因及K-ras基因野生型。2、PC9/AB細胞對EGFR-TKIs敏感性下降MTT法檢測結(jié)果顯示,PC9、PC9/AB細胞均呈無限繁殖。PC9/AB細胞對吉非替尼的增殖作用顯示為濃度依賴性作用,PC9/AB細胞對厄洛替尼的敏感性較PC9細胞顯著下降,IC50值分別為7.23±6.89 μ mo1/L和0.04±0.00 μ mo1/L(P005)。該結(jié)果說明,PC9/AB細胞對EGFR-TKIs產(chǎn)生了獲得性耐藥。3、PC9/AB細胞的形態(tài)學(xué)變化PC9/AB的細胞形態(tài)改變與PC9細胞相比,PC-9/AB細胞形態(tài)傾向梭形發(fā)展,細胞間連接變得更加疏松,符合間質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。4、PC9/AB細胞的遷移及侵襲能力變化劃痕實驗結(jié)果顯示,PC9/AB劃痕兩邊緣距離均明顯縮短。侵襲實驗結(jié)果顯示,PC9/AB穿過Matrigel膠的細胞數(shù)明顯高于原親本細胞。5、PC9/AB的EMT相關(guān)分子和EGFR在蛋白表達的變化western blot結(jié)果顯示,vimentin、snail的蛋白表達水平均明顯增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。EGFR、E-cadherin、β-catenin的蛋白表達水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。以上結(jié)果表明,PC9細胞發(fā)生獲得性耐藥后,發(fā)生了EMT,且EGFR及其磷酸化蛋白表達降低。6、CDH1基因慢病毒過表達載體的構(gòu)建針對CDH1基因成功構(gòu)建了2條過表達慢病毒載體LV-CDH1 (5386-1)-P1、 LV-CDH1(5386-1)-P2以及陰性對照載體CON136; q-PCR法外源篩選出有效過表達慢病毒載體LV-CDH1(5386-1)并進行病毒包裝,獲得了較高滴度的慢病毒顆粒；感染結(jié)果顯示該慢病毒載體能穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)染H460/ER和PC9/AB細胞。Q-PCR方法Western blot結(jié)果表明LV-CDH1(5386-1)慢病毒對H460/ER細胞的CDH1基因的mRNA水平提升了約16倍,蛋白表達水平明顯升高,LV-CDH1(5386-1)慢病毒對PC9/AB細胞的CDH1基因的mRNA水平提升了約4倍,蛋白表達水平明顯升高。7、高表達E-cadherin后的H460/ER和PC9/AB細胞形態(tài)變化與陰性對照細胞相比,PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細胞形態(tài)傾向橢圓形發(fā)展,細胞間連接變得緊密,符合上皮細胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。8、高表達E-cadherin后細胞的遷移和侵襲能力變化劃痕實驗結(jié)果顯示,與陰性對照細胞相比,PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細胞的劃痕兩邊緣距離均明顯增寬。侵襲實驗結(jié)果顯示,陰性對照細胞穿過Matrigel膠的細胞數(shù)明顯高于PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細胞。以上結(jié)果表明,高表達E-cadherin后,PC-9/AB和H460/ER細胞的細胞侵襲和遷移能力均明顯降低。9、高表達E-cadherin后細胞EMT相關(guān)分子的蛋白水平變化與陰性對照細胞相比,PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細胞的vimentin、 snail的蛋白表達水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；E-cadherin、β-catenin的蛋白表達水平均明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。以上結(jié)果表明,高表達E-cadherin后,細胞發(fā)生了去EMT的變化。10、高表達E-cadherin后細胞對EGFR-TKIs的敏感性變化MTT結(jié)果顯示,PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細胞均呈無限繁殖。吉非替尼(0.01～10μmol/L)可抑制PC-9/AB-CDH1細胞生長,該抑制作用呈濃度依賴性；PC9/AB-CDH1與陰性對照細胞相比,對吉非替尼的敏感性增加約11.4倍,IC50值分別為(0.70±0.22)μmol/L和(8.68±0.44)μ mol/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。厄洛替尼(10～100μmol/L)可抑制H460/ER-CDH1細胞生長,該抑制作用呈濃度依賴性；H460/ER-CDH1與陰性對照細胞相比,對厄洛替尼的敏感度增加約6.1倍,IC50值分別為(7.51±1.12)μmol/L和(53.72±12.95)μ mol/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。11、高表達E-cadherin后細胞EGFR基因蛋白水平上的變化western blot結(jié)果顯示,EGFR、p-EGFR蛋白表達水平均明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)：NSCLC細胞在產(chǎn)生EGFR-TKIs耐藥的過程中出現(xiàn)了EMT。逆轉(zhuǎn)耐藥細胞的EMT可提高NSCLC對EGFR-TKIs的敏感性,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在NSCLC對EGFR-TKIs的獲得性耐藥中起重要作用,其機制可能與EGFR磷酸化水平降低有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張曦;張為民;陳蓓;;RNAi介導(dǎo)IGF-1R基因沉默對非小細胞肺癌PC-9/ZD細胞株EMT的影響[J];山東醫(yī)藥;2014年23期

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本文編號：1178727