本文關(guān)鍵詞：FBXW7新的靶蛋白ENO1的鑒定及功能研究

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【摘要】：研究背景FBXW7也稱 FBW7,是F-box蛋白家族成員,為SCF(Skp-Cullin-F-box)泛素連接酶體系的靶蛋白識別組分。人FBXW7基因定位于4號染色體(4q31.3),其表達(dá)產(chǎn)物FBXW7的F-box基序和SKP1直接結(jié)合,形成SCFFBXw7復(fù)合體,并通過其WD40結(jié)構(gòu)域識別特異性底物,介導(dǎo)靶底物的泛素化降解。FBXW7可靶向降解多種癌蛋白,如Cyclin E、 c-Myc、mTOR、Notch1、HIF-1α等,在細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞生長、分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤抗藥性等多個方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。FBXW7是公認(rèn)的腫瘤抑制基因,在多種腫瘤中包括肺癌、胃癌、前列腺癌等存在功能性突變、缺失或表達(dá)降低。目前,FBXW7抑制腫瘤的機(jī)制尚不完全清楚,而其通過調(diào)控特定靶蛋白的含量參與腫瘤抑制作用是最常見的機(jī)制。迄今為止,已經(jīng)鑒定的FBXW7底物比較局限,而FBXW7作用的靶底物不同,其抑癌機(jī)制也不同。因此,發(fā)現(xiàn)、鑒定FBXW7未知的靶底物,研究其與靶底物的作用方式,對進(jìn)一步明確FBXW7的抑癌機(jī)制有非常重要的意義,同時也為闡明FBXW7與其他腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。烯醇酶1(enolase1, ENO1)是糖酵解過程中催化2-磷酸甘油酸形成磷酸烯醇丙酮酸的代謝關(guān)鍵酶,最終促進(jìn)乳酸及ATP的生成。多項研究表明,除了參與糖酵解過程外,ENO1是體內(nèi)重要的多功能蛋白,參與細(xì)胞生長調(diào)控、缺氧耐受、自身免疫調(diào)節(jié)等多種生理過程�，F(xiàn)有的研究報道ENO1在鼻咽癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中表達(dá)增高,且其表達(dá)水平的高低和腫瘤的發(fā)展及不良預(yù)后有關(guān)；在細(xì)胞中過表達(dá)ENO1能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移,表明ENO1可能作為一個癌蛋白促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而,目前對于ENO1的具體表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。我們在前期研究中以篩選鑒定FBXW7的靶蛋白為研究目標(biāo),利用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-DE)與質(zhì)譜技術(shù)(MS)分離鑒定FBXW7基因敲除大腸癌細(xì)胞系HCT116 FBXW7-/-和FBXW7野生型HCI116 FBXW7+/+中差異表達(dá)的蛋白質(zhì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外敲除大腸癌細(xì)胞FBXW7的表達(dá)可明顯上調(diào)ENO1的表達(dá),提示ENO1可能是FBXW7新的靶底物。本研究進(jìn)一步從體外細(xì)胞實(shí)驗和人結(jié)直腸癌組織標(biāo)本兩個層面深入探討了FBXW7對ENO1的調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)理,該研究的完成發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)了新的FBXW7靶蛋白,揭示了FBXW7參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的新機(jī)制,為腫瘤的診斷和治療提供新的思路和靶點(diǎn)。研究目的探討FBXW7對ENO1表達(dá)的調(diào)控作用及作用機(jī)理,并進(jìn)一步闡明FBXW7通過調(diào)控ENO1影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究方法1.在多個細(xì)胞系及臨床組織標(biāo)本中確定FBXW7對ENO1的調(diào)控作用1)在FBXW7野生型結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 FBXW7+/+和DLD-1 FBXW7+/+及利用同源重組技術(shù)建立的FBXW7基因敲除的HCT116 FBXW7-/-和DLD-1 FBXW7-/-細(xì)胞中,應(yīng)用qRT-PCR和Western blotting檢測ENO1的表達(dá)。2)在前列腺癌細(xì)胞系PC3、Du145和乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468中,通過RNA干擾技術(shù)建立FBXW7沉默表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系,應(yīng)用qRT-PCR和Western blotting檢測ENO1的表達(dá)。3)在HCT116 FBXW7-/-和HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FBXW7真核表達(dá)載體,Western blotting檢測ENO1的表達(dá)。4)收集50例結(jié)直腸癌及癌旁組織,免疫組織化學(xué)方法檢測FBXW7和ENO1的表達(dá),分析兩者的相關(guān)性。2.進(jìn)一步實(shí)驗確定FBXW7調(diào)控ENO1蛋白水平的機(jī)理1)運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測FBXW7和ENO1之間的相互作用。2)在HCYU6 FBXW7+/+和FBXW7-/-細(xì)胞中,應(yīng)用放線菌酮示蹤實(shí)驗檢測FBXW7對ENO1半衰期的影響。3) 應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132處理HCT116 FBXW7+/+和FBXW7-/-細(xì)胞,Western blotting檢測ENO1水平的改變。4) 應(yīng)用GSK3β特異的抑制劑GSK3β inhibitor Ⅷ處理HCT116 FBXW7+/+和FBXW7-/-細(xì)胞,Western blotting檢測ENO1水平的改變。5) 運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測FBXW7表達(dá)變化對ENO1的泛素化水平的影響。3.檢測FBXW7調(diào)節(jié)ENO1的功能進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和遷移1) 應(yīng)用ENO1特異的干擾RNA沉默F(xiàn)BXW7和FBXW-/-細(xì)胞中ENO1的表達(dá),qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中CCL20 mRNA的表達(dá)。2) 應(yīng)用ENO1特異的干擾RNA沉默HCT116 FBXW7+/+和FBXW-/-細(xì)胞中ENO1的表達(dá),ATP及乳酸檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ATP及乳酸的含量,檢測FBXW7調(diào)控ENO1對細(xì)胞糖酵解代謝途徑的影響。3) 在ENO1過表達(dá)的HCT116 FBXW7+/+細(xì)胞中過表達(dá)FBXW7或在FBXW7敲除的HCT116 FBXWT7-/-細(xì)胞中沉默ENO1的表達(dá),運(yùn)用MTT和劃痕實(shí)驗檢測FBXW7調(diào)控ENO1對腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響。研究結(jié)果1. FBXW7顯著下調(diào)ENO1蛋白的表達(dá)1) Western blotting檢測結(jié)果顯示FBXW7基因敲除或沉默的細(xì)胞系中ENO1蛋白的表達(dá)顯著增加,而qRT-PCR結(jié)果顯示FBXW7基因敲除或沉默的細(xì)胞系中EN01 mRNA的表達(dá)沒有顯著性差異。2) Western blotting檢測結(jié)果顯示在293T和HC1116FBXW7-/-細(xì)胞中過表達(dá)FBXW7, ENO1蛋白表達(dá)顯著降低。3)免疫組織化學(xué)實(shí)驗結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中FBW7和ENO1水平成明顯的負(fù)相關(guān)。2. FBXW7促進(jìn)ENO1通過蛋白酶體途徑降解1)蛋白質(zhì)免疫共沉淀檢測結(jié)果顯示FBXW7和ENO1存在相互結(jié)合的作用。2)放線菌酮示蹤實(shí)驗結(jié)果顯示FBXW7缺失延長ENO1蛋白的半衰期,FBXW7促進(jìn)ENO1降解。3) Western blotting結(jié)果顯示蛋白酶體抑制劑MG132和GSK3β inhibitorⅦl阻斷FBXW7缺失誘導(dǎo)的ENO1的表達(dá)升高。4)蛋白質(zhì)免疫共沉淀檢測顯示FBXW7可以促進(jìn)ENO1的泛素化。3. FBXW7調(diào)節(jié)ENO1的功能影響細(xì)胞CCL20mRNA、 ATP和乳酸產(chǎn)生及增殖和遷移能力1)qRT-PCR結(jié)果顯示FBXW7通過負(fù)性調(diào)控ENO1抑制細(xì)胞CCL20的表達(dá)。2)ATP及乳酸含量檢測顯示FBXW7通過負(fù)性調(diào)控ENO1抑制細(xì)胞ATP和乳酸的產(chǎn)生。3)MTT和劃痕實(shí)驗結(jié)果顯示FBXW7通過負(fù)性調(diào)控ENO1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。研究結(jié)論和意義我們的研究結(jié)果表明FBXW7可以通過靶向降解ENO1,負(fù)性調(diào)控ENO1的功能從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。目前的研究不僅鑒定了FBXW7新的靶蛋白,而且發(fā)現(xiàn)ENO1新的調(diào)控機(jī)制,有助于我們進(jìn)一步理解FBXW7/ENO1參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李寶國;;結(jié)腸癌診治的回顧與展望[J];齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2010年13期

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本文編號：1178526